摘要：新研究推翻了關(guān)于 CRISPR Cas9 的一個(gè)普遍假設(shè)。
21 世紀(jì)初，當(dāng)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)菌如何保護(hù)自己免受病毒入侵者（噬菌體）的侵害時(shí)，他們幾乎不知道自己偶然發(fā)現(xiàn)了一種可用于編輯活細(xì)胞 DNA 的革命性工具。
這個(gè)名為 CRISPR 的系統(tǒng)被植入到細(xì)菌的基因組中，細(xì)菌可以通過儲(chǔ)存入侵者的基因片段（稱為間隔物）來“記住”過去的病毒攻擊。
在該系統(tǒng)最著名的版本 CRISPR-Cas9 中，這些存儲(chǔ)的記憶隨后被復(fù)制到微小的 RNA 向?qū)е校@些向?qū)?RNA 武裝 Cas9 蛋白，使其像武器一樣在細(xì)菌下次遇到匹配的噬菌體時(shí)切碎入侵者。
為了發(fā)動(dòng)攻擊，Cas9 還依賴一種名為 PAM 的短 DNA 標(biāo)簽，作為“可以在此處切割”的標(biāo)志。
科學(xué)家已經(jīng)修改了 CRISPR-Cas9 來編輯動(dòng)物和人類細(xì)胞，甚至開發(fā)基因療法。
但關(guān)于 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)如何運(yùn)作的一個(gè)關(guān)鍵謎題尚不清楚：細(xì)菌如何形成新的免疫記憶？
圖1 Cas9通過感知CRISPR RNA豐度來調(diào)控CRISPR間隔序列的獲取
為了研究這個(gè)謎團(tuán)，密歇根大學(xué)生物化學(xué)、微生物學(xué)和免疫學(xué)系的Yan Zhang博士實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了一篇論文，推翻了關(guān)于 Cas9 的一個(gè)普遍假設(shè)——即不與其通常的 RNA 伙伴結(jié)合，“空”或 apo 形式的 Cas9 是沒有功能的。
捕捉新的記憶
直到最近，只有少數(shù)基因研究闡明了 CRISPR-Cas9 如何形成免疫記憶，而且這些研究大多局限于 化膿性鏈球菌 （更廣為人知的名稱是 A 組鏈球菌）和 嗜熱鏈球菌 （常見于酸奶中）使用的 II-A 型系統(tǒng)。
在這些 II-A 系統(tǒng)中，Cas9 必須與其 RNA 伙伴之一 tracrRNA 協(xié)同工作，幫助選擇 PAM 旁邊的正確位置來捕獲新的記憶。
然而，在占 Cas9 家族 40% 以上的 II-C 型品牌中，記憶獲取過程尚不十分清楚。
Zhang教授的團(tuán)隊(duì)，包括博士后研究員Xufei Zhou博士和博士生Xin Li，開發(fā)了一種用于研究記憶習(xí)得的新型模型系統(tǒng)，利用腦膜炎奈瑟菌 （可 導(dǎo)致腦膜炎），并用噬菌體感染它，以查看是否可以在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下形成記憶，然后調(diào)整部分免疫機(jī)制以查看會(huì)發(fā)生什么。
“當(dāng)我們開始這個(gè)項(xiàng)目時(shí)，Cas9 已經(jīng)被稱為記憶獲取的 PAM 選擇器。
“這兩種 RNA 的作用尚不清楚，但我們假設(shè)它們對(duì)于 Cas9 幫助細(xì)菌獲得新記憶也一定具有某種重要性，”Zhang教授說。
新的墊片
噬菌體感染后，研究小組利用生物化學(xué)和計(jì)算生物學(xué)與生物信息學(xué)系的同事 Lydia Freddolino 博士和 Rucheng Diao 博士的深度測(cè)序和信息支持，檢查了 CRISPR 陣列的“生長(zhǎng)”前導(dǎo)端。
在那里，他們看到來自病毒基因組的新間隔物被添加。
接下來，他們刪除了tracrRNA基因，并驚訝地發(fā)現(xiàn)間隔物的獲得得到了極大的刺激。
放回 tracrRNA 可使增強(qiáng)的獲取恢復(fù)到正常水平。
在他們對(duì) crRNA 的研究中也出現(xiàn)了類似的模式：沒有 crRNA 時(shí)，Cas9 加快了獲取速度；而隨著 crRNA 的恢復(fù)，獲取速度又下降了。
Zhang教授說：“我們發(fā)現(xiàn)，沒有 RNA，記憶形成就會(huì)受到高度刺激，達(dá)到非常強(qiáng)勁的水平。”
“這對(duì)我們來說真的令人驚訝，我想說，對(duì)整個(gè)領(lǐng)域來說也是如此——因?yàn)镃as9一直以來都被認(rèn)為需要RNA伴侶，無論是作為免疫效應(yīng)器還是基因編輯器。這是首次報(bào)道非RNA負(fù)載的‘空’apoCas9的生物學(xué)功能?！?/div>
圖2 對(duì)于所有Northern和Western印跡實(shí)驗(yàn)，上樣量對(duì)照與目的信號(hào)均在同一塊凝膠/膜上進(jìn)行檢測(cè)。
基于這些發(fā)現(xiàn)，他們提出 Cas9 可以作為 RNA 水平的監(jiān)測(cè)器：當(dāng) CRISPR RNA 豐度較低時(shí)，表明細(xì)菌細(xì)胞攜帶較短的 CRISPR 和較少的免疫記憶，apoCas9 就會(huì)形成，并且可以動(dòng)態(tài)地促進(jìn)間隔區(qū)獲取，通過快速建立記憶庫(kù)來保護(hù)脆弱的細(xì)菌免受感染。
圖2 對(duì)于所有Northern和Western印跡實(shí)驗(yàn)，上樣量對(duì)照與目的信號(hào)均在同一塊凝膠/膜上進(jìn)行檢測(cè)。
短暫免疫記憶
研究小組進(jìn)一步證明了細(xì)菌可能遇到 CRISPR 陣列過短的三種自然條件。
一個(gè)階段是最早的進(jìn)化階段，此時(shí)陣列剛剛誕生，并且只包含很少（如果有的話）間隔內(nèi)容。
在這個(gè)階段，Cas9 將沒有其 CRISPR RNA 伴侶，并且主要以 apo 形式存在。
第二種和第三種情況都涉及較長(zhǎng)的 CRISPR 陣列突然坍縮為較短的陣列，這要么是細(xì)菌拋棄不需要的有害或自身免疫記憶以獲得新的有益特性的一種方式，要么是同源重組的結(jié)果，即兩個(gè)相似的 DNA 序列（又名 CRISPR 重復(fù)）交換片段，從而在此過程中抹去中間的 CRISPR 記憶。
這項(xiàng)研究擴(kuò)展了 Cas9 的已知功能，并填補(bǔ)了 CRISPR-Cas9 如何維持記憶穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵缺失部分。
這種動(dòng)態(tài)反饋回路為細(xì)菌如何保護(hù)其免疫記憶的深度提供了一種新的思維方式。
它還可能啟發(fā)設(shè)計(jì)基于 CRISPR 的分子記錄或 DNA 條形碼工具用于研究和醫(yī)學(xué)的新方法。
參考資料
[1] Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition
摘要：新研究推翻了關(guān)于 CRISPR Cas9 的一個(gè)普遍假設(shè)。
21 世紀(jì)初，當(dāng)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)菌如何保護(hù)自己免受病毒入侵者（噬菌體）的侵害時(shí)，他們幾乎不知道自己偶然發(fā)現(xiàn)了一種可用于編輯活細(xì)胞 DNA 的革命性工具。
這個(gè)名為 CRISPR 的系統(tǒng)被植入到細(xì)菌的基因組中，細(xì)菌可以通過儲(chǔ)存入侵者的基因片段（稱為間隔物）來“記住”過去的病毒攻擊。
在該系統(tǒng)最著名的版本 CRISPR-Cas9 中，這些存儲(chǔ)的記憶隨后被復(fù)制到微小的 RNA 向?qū)е?，這些向?qū)?RNA 武裝 Cas9 蛋白，使其像武器一樣在細(xì)菌下次遇到匹配的噬菌體時(shí)切碎入侵者。
為了發(fā)動(dòng)攻擊，Cas9 還依賴一種名為 PAM 的短 DNA 標(biāo)簽，作為“可以在此處切割”的標(biāo)志。
科學(xué)家已經(jīng)修改了 CRISPR-Cas9 來編輯動(dòng)物和人類細(xì)胞，甚至開發(fā)基因療法。
但關(guān)于 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)如何運(yùn)作的一個(gè)關(guān)鍵謎題尚不清楚：細(xì)菌如何形成新的免疫記憶？
圖1 Cas9通過感知CRISPR RNA豐度來調(diào)控CRISPR間隔序列的獲取
為了研究這個(gè)謎團(tuán)，密歇根大學(xué)生物化學(xué)、微生物學(xué)和免疫學(xué)系的Yan Zhang博士實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了一篇論文，推翻了關(guān)于 Cas9 的一個(gè)普遍假設(shè)——即不與其通常的 RNA 伙伴結(jié)合，“空”或 apo 形式的 Cas9 是沒有功能的。
捕捉新的記憶
直到最近，只有少數(shù)基因研究闡明了 CRISPR-Cas9 如何形成免疫記憶，而且這些研究大多局限于 化膿性鏈球菌 （更廣為人知的名稱是 A 組鏈球菌）和 嗜熱鏈球菌 （常見于酸奶中）使用的 II-A 型系統(tǒng)。
在這些 II-A 系統(tǒng)中，Cas9 必須與其 RNA 伙伴之一 tracrRNA 協(xié)同工作，幫助選擇 PAM 旁邊的正確位置來捕獲新的記憶。
然而，在占 Cas9 家族 40% 以上的 II-C 型品牌中，記憶獲取過程尚不十分清楚。
Zhang教授的團(tuán)隊(duì)，包括博士后研究員Xufei Zhou博士和博士生Xin Li，開發(fā)了一種用于研究記憶習(xí)得的新型模型系統(tǒng)，利用腦膜炎奈瑟菌 （可 導(dǎo)致腦膜炎），并用噬菌體感染它，以查看是否可以在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下形成記憶，然后調(diào)整部分免疫機(jī)制以查看會(huì)發(fā)生什么。
“當(dāng)我們開始這個(gè)項(xiàng)目時(shí)，Cas9 已經(jīng)被稱為記憶獲取的 PAM 選擇器。
“這兩種 RNA 的作用尚不清楚，但我們假設(shè)它們對(duì)于 Cas9 幫助細(xì)菌獲得新記憶也一定具有某種重要性，”Zhang教授說。
新的墊片
噬菌體感染后，研究小組利用生物化學(xué)和計(jì)算生物學(xué)與生物信息學(xué)系的同事 Lydia Freddolino 博士和 Rucheng Diao 博士的深度測(cè)序和信息支持，檢查了 CRISPR 陣列的“生長(zhǎng)”前導(dǎo)端。
在那里，他們看到來自病毒基因組的新間隔物被添加。
接下來，他們刪除了tracrRNA基因，并驚訝地發(fā)現(xiàn)間隔物的獲得得到了極大的刺激。
放回 tracrRNA 可使增強(qiáng)的獲取恢復(fù)到正常水平。
在他們對(duì) crRNA 的研究中也出現(xiàn)了類似的模式：沒有 crRNA 時(shí)，Cas9 加快了獲取速度；而隨著 crRNA 的恢復(fù)，獲取速度又下降了。
Zhang教授說：“我們發(fā)現(xiàn)，沒有 RNA，記憶形成就會(huì)受到高度刺激，達(dá)到非常強(qiáng)勁的水平。”
“這對(duì)我們來說真的令人驚訝，我想說，對(duì)整個(gè)領(lǐng)域來說也是如此——因?yàn)镃as9一直以來都被認(rèn)為需要RNA伴侶，無論是作為免疫效應(yīng)器還是基因編輯器。這是首次報(bào)道非RNA負(fù)載的‘空’apoCas9的生物學(xué)功能?！?/div>
圖2 對(duì)于所有Northern和Western印跡實(shí)驗(yàn)，上樣量對(duì)照與目的信號(hào)均在同一塊凝膠/膜上進(jìn)行檢測(cè)。
基于這些發(fā)現(xiàn)，他們提出 Cas9 可以作為 RNA 水平的監(jiān)測(cè)器：當(dāng) CRISPR RNA 豐度較低時(shí)，表明細(xì)菌細(xì)胞攜帶較短的 CRISPR 和較少的免疫記憶，apoCas9 就會(huì)形成，并且可以動(dòng)態(tài)地促進(jìn)間隔區(qū)獲取，通過快速建立記憶庫(kù)來保護(hù)脆弱的細(xì)菌免受感染。
圖2 對(duì)于所有Northern和Western印跡實(shí)驗(yàn)，上樣量對(duì)照與目的信號(hào)均在同一塊凝膠/膜上進(jìn)行檢測(cè)。
短暫免疫記憶
研究小組進(jìn)一步證明了細(xì)菌可能遇到 CRISPR 陣列過短的三種自然條件。
一個(gè)階段是最早的進(jìn)化階段，此時(shí)陣列剛剛誕生，并且只包含很少（如果有的話）間隔內(nèi)容。
在這個(gè)階段，Cas9 將沒有其 CRISPR RNA 伴侶，并且主要以 apo 形式存在。
第二種和第三種情況都涉及較長(zhǎng)的 CRISPR 陣列突然坍縮為較短的陣列，這要么是細(xì)菌拋棄不需要的有害或自身免疫記憶以獲得新的有益特性的一種方式，要么是同源重組的結(jié)果，即兩個(gè)相似的 DNA 序列（又名 CRISPR 重復(fù)）交換片段，從而在此過程中抹去中間的 CRISPR 記憶。
這項(xiàng)研究擴(kuò)展了 Cas9 的已知功能，并填補(bǔ)了 CRISPR-Cas9 如何維持記憶穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵缺失部分。
這種動(dòng)態(tài)反饋回路為細(xì)菌如何保護(hù)其免疫記憶的深度提供了一種新的思維方式。
它還可能啟發(fā)設(shè)計(jì)基于 CRISPR 的分子記錄或 DNA 條形碼工具用于研究和醫(yī)學(xué)的新方法。
參考資料
[1] Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition
