摘要：本研究揭示了核苷酸代謝失衡導致核糖核苷酸誤摻入線粒體DNA，引發(fā)mtDNA片段釋放至胞質(zhì)。
代謝紊亂與炎癥反應密切相關(guān)，但核苷酸缺乏如何驅(qū)動線粒體DNA（mtDNA）依賴性炎癥的具體機制尚未明確。線粒體作為細胞能量工廠和信號樞紐，其功能異常會引發(fā)炎癥、細胞死亡和疾病。多種應激因素（如病原體感染、mtDNA包裝缺陷、嘧啶代謝障礙等）可導致mtDNA釋放到胞質(zhì)，通過cGAS-STING-TBK1信號通路激活I(lǐng)型干擾素和干擾素刺激基因（ISGs）表達。這一反應雖有助于抗病原體防御，但過度激活會促進自身免疫病、炎癥性疾病及衰老進程。
近期研究表明，線粒體蛋白酶YME1L通過重塑線粒體蛋白質(zhì)組響應營養(yǎng)應激，支持回補反應和嘧啶代謝，對某些實體瘤生長和成體神經(jīng)干細胞維持至關(guān)重要。YME1L缺失或化療藥物抑制胞質(zhì)嘧啶合成會引發(fā)核苷酸失衡，導致mtDNA釋放和炎癥。然而，核苷酸失衡或其他線粒體應激源影響mtDNA并導致其釋放的具體機制仍不清楚。
圖1 核糖核苷酸摻入線粒體DNA驅(qū)動炎癥反應
本研究團隊發(fā)現(xiàn)，缺乏線粒體核酸酶MGME1的小鼠（Mgme1-/-）在約1歲時出現(xiàn)腎臟炎癥并過早死于腎衰竭。為探究線粒體依賴性先天免疫信號是否參與該表型，研究人員監(jiān)測了不同年齡野生型（WT）和Mgme1-/-小鼠腎臟中ISGs的mRNA水平。結(jié)果顯示，隨著衰老進程，Mgme1-/-小鼠ISG表達逐漸誘導，70周齡時達到最高。該反應具有組織特異性，在55周齡Mgme1-/-小鼠的脾臟、心臟、肝臟或腦組織中未觀察到類似現(xiàn)象。
通過分離55周齡小鼠腎臟線粒體和胞質(zhì)組分，并采用針對mtDNA控制區(qū)、大弧和小弧的特異性探針進行數(shù)字PCR（dPCR）分析，發(fā)現(xiàn)Mgme1-/-腎臟胞質(zhì)中存在mtDNA，且這些片段主要富集于重鏈復制起點（OH）附近區(qū)域。肝臟胞質(zhì)中也可檢測到mtDNA片段，但水平較低，與肝臟缺乏炎癥的現(xiàn)象一致。這可能是因為3'修復核酸酶1（TREX1）等胞質(zhì)DNA清除機制在低水平mtDNA釋放時足以預防天然免疫反應激活。
為驗證胞質(zhì)mtDNA片段是否通過cGAS-STING-TBK1信號通路觸發(fā)炎癥反應，研究人員將Mgme1-/-小鼠與攜帶功能缺失突變Sting1mut/mut（編碼STING）的小鼠雜交，獲得雙敲除（DKO）小鼠。55周齡Mgme1-/-小鼠腎臟中強烈的ISG反應在STING缺失后顯著減弱，表明STING在體內(nèi)炎癥反應中起關(guān)鍵作用。組織學分析顯示，STING消融改善了Mgme1-/-小鼠的腎臟表型，包括腎小球硬化、蛋白管型形成及B220+和CD3+T細胞的腎周浸潤。
在細胞模型中，Mgme1-/-原代小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）表現(xiàn)出顯著ISG反應，STING1缺失后該反應被強烈抑制。消耗cGAS或STING，或用BX795抑制TBK1，可抑制永生化Mgme1-/-細胞中ISG表達，而RNA傳感器的缺失無此效應。此外，基礎條件下主要位于核內(nèi)的cGAS在Mgme1-/-細胞胞質(zhì)中積累。數(shù)字液滴PCR（ddPCR）和細胞分餾實驗檢測到Mgme1-/- MEFs胞質(zhì)mtDNA水平增加，免疫熒光顯微鏡顯示胞質(zhì)DNA焦點數(shù)量和細胞比例升高。用鏈終止核苷酸類似物2',3'-雙脫氧胞苷（ddC）消耗mtDNA后，MGME1缺失或Mgme1缺陷細胞中的天然免疫信號被抑制。這些實驗證明MGME1缺失導致mtDNA釋放到胞質(zhì)，激活cGAS-STING-TBK1信號和ISGs表達。
由于MGME1作為線粒體復制核酸酶的功能，研究人員推測受損的mtDNA復制可能觸發(fā)mtDNA依賴性免疫反應。但與其他mtDNA復制酶（如Polrmt、Rnasch1）缺失不同，Mgme1-/-細胞中ISG反應依然存在。相反，消耗解旋酶Twinkle或Ssbp1可抑制Mgme1-/-細胞中的ISG反應，表明持續(xù)的mtDNA合成是觸發(fā)mtDNA釋放所必需的。
對Mgme1-/-小鼠腎臟mtDNA進行測序，發(fā)現(xiàn)隨距離OH增加，序列覆蓋率下降，與之前腦和心臟組織中的復制停滯表型一致。深度測序分析提示Mgme1-/-腎臟中從OH起始的mtDNA復制事件增多，這可能解釋mtDNA依賴性炎癥的組織特異性。增加的復制起始可能導致脫氧核苷酸池耗竭，引起細胞核苷酸失衡和mtDNA依賴性天然免疫信號傳導。
通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析Mgme1-/-細胞核苷酸水平，發(fā)現(xiàn)脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）降低，核糖核苷酸單磷酸（rNMPs）顯著增加。消耗SAMHD1（一種脫氧核苷酸三磷酸三磷酸水解酶）可恢復dNTP水平并抑制ISG反應。消耗線粒體嘧啶核苷酸載體SLC25A33（支持mtDNA復制的嘧啶核苷酸線粒體攝取載體）也可降低Mgme1-/-細胞中的ISG表達。這些結(jié)果表明，核苷酸代謝紊亂 combined with altered mtDNA replication triggers mtDNA release and cGAS-STING-TBK1 signalling in Mgme1-/- cells.
圖2 Mgme1?/?小鼠的遲發(fā)性腎炎
研究人員進一步發(fā)現(xiàn)，Mgme1-/-細胞中核糖核苷酸三磷酸（rNTP）與dNTP的比率升高。YME1L缺失和用5-氟尿嘧啶（5-FU）抑制胞質(zhì)胸苷酸合酶（均已知可觸發(fā)mtDNA依賴性天然免疫信號）也增加rNTP/dNTP比率。真核細胞中rNTP相對于dNTP過量存在，盡管復制聚合酶對dNTP高度選擇，但rNTP的錯誤摻入可能挑戰(zhàn)DNA復制，導致DNA鏈斷裂、基因組不穩(wěn)定和自身免疫疾病。核糖核苷酸切除修復（涉及RNase H2）限制了核DNA中的rNMP含量，但線粒體中缺乏清除核糖核苷酸的機制，使mtDNA易受rNTP摻入影響。
通過水解末端測序（HydEn-seq）和堿性凝膠電泳分析，直接定量了WT和Yme1l-/-細胞mtDNA中的rNMP含量。結(jié)果顯示Yme1l-/-細胞重鏈中鳥嘌呤核糖核苷酸相對增加。堿性條件下，Yme1l-/-細胞mtDNA顯示不同的降解模式和更短DNA片段形成，表明對堿性的敏感性增加，提示rNTP摻入增多。Mgme1-/-細胞中也觀察到類似現(xiàn)象，重鏈中鳥嘌呤核糖核苷酸水平顯著更高，輕鏈中胞苷核糖核苷酸插入增加，兩條鏈中腺苷核糖核苷酸摻入減少。55周齡Mgme1-/-小鼠腎臟mtDNA對堿性和RNase H2處理敏感性增加，表明體內(nèi)mtDNA rNMP含量升高。
在細胞衰老模型中，研究人員用羥基脲（HU）（胞質(zhì)核糖核苷酸還原酶（RNR）的有效抑制劑）處理WT細胞，也觀察到mtDNA rNMP含量增加。RNR由兩個非同源亞基RRM1和RRM2組成，RRM2表達呈細胞周期依賴性，在細胞周期停滯的衰老細胞中停止，導致dNTP水平降低。由于mtDNA釋放有助于衰老細胞的促炎SASP，且mtDNA復制與細胞周期無關(guān)，研究人員推測改變的rNTP/dNTP比率和增加的rNTP摻入mtDNA可能觸發(fā)衰老細胞中的mtDNA釋放和SASP。
通過電離輻射（IR）或治療誘導衰老（TIS）處理人肺IMR90成纖維細胞，研究人員證實衰老狀態(tài)的建立（通過SA-β-gal活性和衰老相關(guān)蛋白標志物變化驗證）。代謝組學分析顯示IR或TIS后rNTP/dNTP比率增加。堿性凝膠電泳分析顯示IR處理后衰老細胞mtDNA對堿性和RNase H2處理敏感性增加，表明這些細胞mtDNA的rNMP含量更高。在地西他濱或多柔比星處理的衰老IMR90成纖維細胞及照射后的腎近端小管上皮細胞中也觀察到類似現(xiàn)象。
為驗證mtDNA rNMP含量增加是否影響mtDNA釋放和SASP，研究人員用脫氧核糖核苷補充衰老細胞。脫氧核糖核苷補充不影響衰老狀態(tài)本身，但顯著減少胞質(zhì)mtDNA和mtDNA對堿及RNase H2處理的敏感性，表明rNMP含量降低。dNTP補充衰老細胞后，rNTP摻入減少，炎癥性SASP基因表達被抑制。這表明SASP基因表達依賴于衰老細胞mtDNA中rNTP摻入的增加。
在自然衰老過程中，研究人員對老年小鼠腎臟、肝臟、心臟和脾臟進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)所有組織中rNTP/dNTP比率均增加，且對不同核苷酸有多樣化影響。從這些組織分離的mtDNA對堿性和RNase H2處理的敏感性較年輕小鼠增加，證明老年組織中rNTP摻入增加。
本研究使用的主要技術(shù)方法包括：基因敲除小鼠模型構(gòu)建、細胞分餾和數(shù)字PCR（dPCR/ddPCR）檢測胞質(zhì)mtDNA、RNA干擾技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析核苷酸水平、水解末端測序（HydEn-seq）檢測mtDNA中核糖核苷酸摻入、堿性凝膠電泳和Southern blot分析、體外復制 assays 使用重組蛋白、納米字符串（NanoString）技術(shù)分析ISG表達譜、免疫組化和免疫熒光分析。樣本來源包括：Mgme1-/-小鼠腎臟、肝臟等組織，原代和永生化MEF細胞，人肺成纖維細胞IMR90，以及衰老模型細胞。
本研究結(jié)論表明，核苷酸代謝失衡導致rNTP誤摻入mtDNA，引起mtDNA鏈斷裂和片段釋放，激活cGAS-STING依賴的炎癥反應和SASP。這不僅解釋了Mgme1-/-小鼠年齡依賴性腎炎癥的機制，也為線粒體疾?。ㄈ鏡RM2B突變引起的mtDNA耗竭綜合征）中的炎癥反應提供了分子基礎。老年組織中mtDNA rNMP含量增加進一步支持了mtDNA在自然衰老過程中促進炎癥反應的作用。這一發(fā)現(xiàn)對治療年齡相關(guān)炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥具有深遠意義。
該研究由德國馬克斯·普朗克衰老生物學研究所、哥德堡大學生物醫(yī)學研究所、劍橋大學MRC線粒體生物學單元、卡羅林斯卡醫(yī)學院醫(yī)學生物化學與生物物理學系、弗萊堡大學醫(yī)學中心外科病理學研究所、科隆大學CECAD應激反應卓越集群等機構(gòu)合作完成，發(fā)表于《Nature》期刊。
參考資料
[1] Ribonucleotide incorporation into mitochondrial DNA drives inflammation
摘要：本研究揭示了核苷酸代謝失衡導致核糖核苷酸誤摻入線粒體DNA，引發(fā)mtDNA片段釋放至胞質(zhì)。
代謝紊亂與炎癥反應密切相關(guān)，但核苷酸缺乏如何驅(qū)動線粒體DNA（mtDNA）依賴性炎癥的具體機制尚未明確。線粒體作為細胞能量工廠和信號樞紐，其功能異常會引發(fā)炎癥、細胞死亡和疾病。多種應激因素（如病原體感染、mtDNA包裝缺陷、嘧啶代謝障礙等）可導致mtDNA釋放到胞質(zhì)，通過cGAS-STING-TBK1信號通路激活I(lǐng)型干擾素和干擾素刺激基因（ISGs）表達。這一反應雖有助于抗病原體防御，但過度激活會促進自身免疫病、炎癥性疾病及衰老進程。
近期研究表明，線粒體蛋白酶YME1L通過重塑線粒體蛋白質(zhì)組響應營養(yǎng)應激，支持回補反應和嘧啶代謝，對某些實體瘤生長和成體神經(jīng)干細胞維持至關(guān)重要。YME1L缺失或化療藥物抑制胞質(zhì)嘧啶合成會引發(fā)核苷酸失衡，導致mtDNA釋放和炎癥。然而，核苷酸失衡或其他線粒體應激源影響mtDNA并導致其釋放的具體機制仍不清楚。
圖1 核糖核苷酸摻入線粒體DNA驅(qū)動炎癥反應
本研究團隊發(fā)現(xiàn)，缺乏線粒體核酸酶MGME1的小鼠（Mgme1-/-）在約1歲時出現(xiàn)腎臟炎癥并過早死于腎衰竭。為探究線粒體依賴性先天免疫信號是否參與該表型，研究人員監(jiān)測了不同年齡野生型（WT）和Mgme1-/-小鼠腎臟中ISGs的mRNA水平。結(jié)果顯示，隨著衰老進程，Mgme1-/-小鼠ISG表達逐漸誘導，70周齡時達到最高。該反應具有組織特異性，在55周齡Mgme1-/-小鼠的脾臟、心臟、肝臟或腦組織中未觀察到類似現(xiàn)象。
通過分離55周齡小鼠腎臟線粒體和胞質(zhì)組分，并采用針對mtDNA控制區(qū)、大弧和小弧的特異性探針進行數(shù)字PCR（dPCR）分析，發(fā)現(xiàn)Mgme1-/-腎臟胞質(zhì)中存在mtDNA，且這些片段主要富集于重鏈復制起點（OH）附近區(qū)域。肝臟胞質(zhì)中也可檢測到mtDNA片段，但水平較低，與肝臟缺乏炎癥的現(xiàn)象一致。這可能是因為3'修復核酸酶1（TREX1）等胞質(zhì)DNA清除機制在低水平mtDNA釋放時足以預防天然免疫反應激活。
為驗證胞質(zhì)mtDNA片段是否通過cGAS-STING-TBK1信號通路觸發(fā)炎癥反應，研究人員將Mgme1-/-小鼠與攜帶功能缺失突變Sting1mut/mut（編碼STING）的小鼠雜交，獲得雙敲除（DKO）小鼠。55周齡Mgme1-/-小鼠腎臟中強烈的ISG反應在STING缺失后顯著減弱，表明STING在體內(nèi)炎癥反應中起關(guān)鍵作用。組織學分析顯示，STING消融改善了Mgme1-/-小鼠的腎臟表型，包括腎小球硬化、蛋白管型形成及B220+和CD3+T細胞的腎周浸潤。
在細胞模型中，Mgme1-/-原代小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）表現(xiàn)出顯著ISG反應，STING1缺失后該反應被強烈抑制。消耗cGAS或STING，或用BX795抑制TBK1，可抑制永生化Mgme1-/-細胞中ISG表達，而RNA傳感器的缺失無此效應。此外，基礎條件下主要位于核內(nèi)的cGAS在Mgme1-/-細胞胞質(zhì)中積累。數(shù)字液滴PCR（ddPCR）和細胞分餾實驗檢測到Mgme1-/- MEFs胞質(zhì)mtDNA水平增加，免疫熒光顯微鏡顯示胞質(zhì)DNA焦點數(shù)量和細胞比例升高。用鏈終止核苷酸類似物2',3'-雙脫氧胞苷（ddC）消耗mtDNA后，MGME1缺失或Mgme1缺陷細胞中的天然免疫信號被抑制。這些實驗證明MGME1缺失導致mtDNA釋放到胞質(zhì)，激活cGAS-STING-TBK1信號和ISGs表達。
由于MGME1作為線粒體復制核酸酶的功能，研究人員推測受損的mtDNA復制可能觸發(fā)mtDNA依賴性免疫反應。但與其他mtDNA復制酶（如Polrmt、Rnasch1）缺失不同，Mgme1-/-細胞中ISG反應依然存在。相反，消耗解旋酶Twinkle或Ssbp1可抑制Mgme1-/-細胞中的ISG反應，表明持續(xù)的mtDNA合成是觸發(fā)mtDNA釋放所必需的。
對Mgme1-/-小鼠腎臟mtDNA進行測序，發(fā)現(xiàn)隨距離OH增加，序列覆蓋率下降，與之前腦和心臟組織中的復制停滯表型一致。深度測序分析提示Mgme1-/-腎臟中從OH起始的mtDNA復制事件增多，這可能解釋mtDNA依賴性炎癥的組織特異性。增加的復制起始可能導致脫氧核苷酸池耗竭，引起細胞核苷酸失衡和mtDNA依賴性天然免疫信號傳導。
通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析Mgme1-/-細胞核苷酸水平，發(fā)現(xiàn)脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）降低，核糖核苷酸單磷酸（rNMPs）顯著增加。消耗SAMHD1（一種脫氧核苷酸三磷酸三磷酸水解酶）可恢復dNTP水平并抑制ISG反應。消耗線粒體嘧啶核苷酸載體SLC25A33（支持mtDNA復制的嘧啶核苷酸線粒體攝取載體）也可降低Mgme1-/-細胞中的ISG表達。這些結(jié)果表明，核苷酸代謝紊亂 combined with altered mtDNA replication triggers mtDNA release and cGAS-STING-TBK1 signalling in Mgme1-/- cells.
圖2 Mgme1?/?小鼠的遲發(fā)性腎炎
研究人員進一步發(fā)現(xiàn)，Mgme1-/-細胞中核糖核苷酸三磷酸（rNTP）與dNTP的比率升高。YME1L缺失和用5-氟尿嘧啶（5-FU）抑制胞質(zhì)胸苷酸合酶（均已知可觸發(fā)mtDNA依賴性天然免疫信號）也增加rNTP/dNTP比率。真核細胞中rNTP相對于dNTP過量存在，盡管復制聚合酶對dNTP高度選擇，但rNTP的錯誤摻入可能挑戰(zhàn)DNA復制，導致DNA鏈斷裂、基因組不穩(wěn)定和自身免疫疾病。核糖核苷酸切除修復（涉及RNase H2）限制了核DNA中的rNMP含量，但線粒體中缺乏清除核糖核苷酸的機制，使mtDNA易受rNTP摻入影響。
通過水解末端測序（HydEn-seq）和堿性凝膠電泳分析，直接定量了WT和Yme1l-/-細胞mtDNA中的rNMP含量。結(jié)果顯示Yme1l-/-細胞重鏈中鳥嘌呤核糖核苷酸相對增加。堿性條件下，Yme1l-/-細胞mtDNA顯示不同的降解模式和更短DNA片段形成，表明對堿性的敏感性增加，提示rNTP摻入增多。Mgme1-/-細胞中也觀察到類似現(xiàn)象，重鏈中鳥嘌呤核糖核苷酸水平顯著更高，輕鏈中胞苷核糖核苷酸插入增加，兩條鏈中腺苷核糖核苷酸摻入減少。55周齡Mgme1-/-小鼠腎臟mtDNA對堿性和RNase H2處理敏感性增加，表明體內(nèi)mtDNA rNMP含量升高。
在細胞衰老模型中，研究人員用羥基脲（HU）（胞質(zhì)核糖核苷酸還原酶（RNR）的有效抑制劑）處理WT細胞，也觀察到mtDNA rNMP含量增加。RNR由兩個非同源亞基RRM1和RRM2組成，RRM2表達呈細胞周期依賴性，在細胞周期停滯的衰老細胞中停止，導致dNTP水平降低。由于mtDNA釋放有助于衰老細胞的促炎SASP，且mtDNA復制與細胞周期無關(guān)，研究人員推測改變的rNTP/dNTP比率和增加的rNTP摻入mtDNA可能觸發(fā)衰老細胞中的mtDNA釋放和SASP。
通過電離輻射（IR）或治療誘導衰老（TIS）處理人肺IMR90成纖維細胞，研究人員證實衰老狀態(tài)的建立（通過SA-β-gal活性和衰老相關(guān)蛋白標志物變化驗證）。代謝組學分析顯示IR或TIS后rNTP/dNTP比率增加。堿性凝膠電泳分析顯示IR處理后衰老細胞mtDNA對堿性和RNase H2處理敏感性增加，表明這些細胞mtDNA的rNMP含量更高。在地西他濱或多柔比星處理的衰老IMR90成纖維細胞及照射后的腎近端小管上皮細胞中也觀察到類似現(xiàn)象。
為驗證mtDNA rNMP含量增加是否影響mtDNA釋放和SASP，研究人員用脫氧核糖核苷補充衰老細胞。脫氧核糖核苷補充不影響衰老狀態(tài)本身，但顯著減少胞質(zhì)mtDNA和mtDNA對堿及RNase H2處理的敏感性，表明rNMP含量降低。dNTP補充衰老細胞后，rNTP摻入減少，炎癥性SASP基因表達被抑制。這表明SASP基因表達依賴于衰老細胞mtDNA中rNTP摻入的增加。
在自然衰老過程中，研究人員對老年小鼠腎臟、肝臟、心臟和脾臟進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)所有組織中rNTP/dNTP比率均增加，且對不同核苷酸有多樣化影響。從這些組織分離的mtDNA對堿性和RNase H2處理的敏感性較年輕小鼠增加，證明老年組織中rNTP摻入增加。
本研究使用的主要技術(shù)方法包括：基因敲除小鼠模型構(gòu)建、細胞分餾和數(shù)字PCR（dPCR/ddPCR）檢測胞質(zhì)mtDNA、RNA干擾技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析核苷酸水平、水解末端測序（HydEn-seq）檢測mtDNA中核糖核苷酸摻入、堿性凝膠電泳和Southern blot分析、體外復制 assays 使用重組蛋白、納米字符串（NanoString）技術(shù)分析ISG表達譜、免疫組化和免疫熒光分析。樣本來源包括：Mgme1-/-小鼠腎臟、肝臟等組織，原代和永生化MEF細胞，人肺成纖維細胞IMR90，以及衰老模型細胞。
本研究結(jié)論表明，核苷酸代謝失衡導致rNTP誤摻入mtDNA，引起mtDNA鏈斷裂和片段釋放，激活cGAS-STING依賴的炎癥反應和SASP。這不僅解釋了Mgme1-/-小鼠年齡依賴性腎炎癥的機制，也為線粒體疾?。ㄈ鏡RM2B突變引起的mtDNA耗竭綜合征）中的炎癥反應提供了分子基礎。老年組織中mtDNA rNMP含量增加進一步支持了mtDNA在自然衰老過程中促進炎癥反應的作用。這一發(fā)現(xiàn)對治療年齡相關(guān)炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥具有深遠意義。
該研究由德國馬克斯·普朗克衰老生物學研究所、哥德堡大學生物醫(yī)學研究所、劍橋大學MRC線粒體生物學單元、卡羅林斯卡醫(yī)學院醫(yī)學生物化學與生物物理學系、弗萊堡大學醫(yī)學中心外科病理學研究所、科隆大學CECAD應激反應卓越集群等機構(gòu)合作完成，發(fā)表于《Nature》期刊。
參考資料
[1] Ribonucleotide incorporation into mitochondrial DNA drives inflammation
