摘要：本研究揭示了組蛋白H3K9乳酸化（H3K9la）通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控NFATc2表達(dá)促進(jìn)纖維樣滑膜細(xì)胞（FLSs）遷移侵襲的新機(jī)制。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一種以慢性滑膜炎、自身抗體產(chǎn)生和關(guān)節(jié)骨破壞為特征的自身免疫性疾病。在RA患者的關(guān)節(jié)微環(huán)境中，缺氧和代謝重編程導(dǎo)致乳酸大量積累，形成高乳酸微環(huán)境。雖然既往研究提示乳酸可能參與RA進(jìn)展，但其具體分子機(jī)制始終不明。近年來，乳酸被發(fā)現(xiàn)在腫瘤免疫等領(lǐng)域作為信號分子發(fā)揮重要調(diào)控作用，特別是組蛋白乳酸化作為一種新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在多種疾病中被證實(shí)具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。然而，組蛋白乳酸化是否在RA發(fā)病過程中發(fā)揮作用，以及是否參與自身抗體的產(chǎn)生，仍有待深入探索。
溫州醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》發(fā)表的最新研究，首次系統(tǒng)揭示了組蛋白乳酸化修飾在RA疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。研究人員通過整合多組學(xué)分析、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和動物模型驗(yàn)證，闡明了乳酸依賴性組蛋白修飾調(diào)控纖維樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like Synoviocytes, FLSs）致病性的新機(jī)制，并為RA診斷提供了新型血清學(xué)標(biāo)志物。
圖1 組蛋白乳酸化通過增加NFATc2表達(dá)及抗乳酸化組蛋白自身抗體產(chǎn)生促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)展
研究采用的主要技術(shù)方法包括：Western blot和免疫熒光檢測組蛋白乳酸化水平；CUT & Tag技術(shù)（切割標(biāo)簽技術(shù)）聯(lián)合RNA測序篩選H3K9la靶基因；染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP-qPCR）驗(yàn)證組蛋白修飾與基因啟動子結(jié)合；利用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）和膠原抗體誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CAIA）小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)功能驗(yàn)證；ELISA檢測血清自身抗體水平。所有人類樣本均來源于未經(jīng)疾病修飾抗風(fēng)濕藥（DMARDs）治療的新診斷RA患者。
研究結(jié)果
組蛋白H3K9乳酸化在RA患者滑膜組織中顯著升高
研究人員首先發(fā)現(xiàn)RA患者FLSs中全局乳酸化水平顯著高于健康對照（HC）和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）患者，且乳酸化蛋白富集于分子量15kDa的核內(nèi)蛋白。通過pH對照實(shí)驗(yàn)排除酸性環(huán)境干擾，證實(shí)乳酸鈉和乳酸處理均可特異性增強(qiáng)FLSs的乳酸化修飾。進(jìn)一步針對8個已知組蛋白乳酸化位點(diǎn)的檢測顯示，H3K9la在RA患者FLSs和滑膜組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且乳酸處理可明顯促進(jìn)H3K9la水平。
NFATc2被篩選確認(rèn)為H3K9la的關(guān)鍵靶基因
通過CUT & Tag技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，H3K9la在RA-FLSs中更多富集于基因啟動子區(qū)域，且結(jié)合基序與HC存在差異（RA中為"GKACTGTA"，HC中為"SKGTATAC"）。KEGG通路分析顯示H3K9la結(jié)合基因顯著富集于"類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎"通路。整合RNA-seq數(shù)據(jù)篩選出68個同時存在H3K9la高結(jié)合且表達(dá)上調(diào)的靶基因，其中7個基因與"細(xì)胞運(yùn)動性"功能相關(guān)。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)NFATc2和IL12A啟動子區(qū)域存在H3K9la結(jié)合基序，且NFATc2表達(dá)差異最顯著。ChIP-qPCR證實(shí)H3K9la在NFATc2啟動子區(qū)域高度富集，RT-qPCR驗(yàn)證NFATc2在RA-FLSs中表達(dá)上調(diào)。
NFATc2過表達(dá)通過增強(qiáng)FLS遷移侵襲促進(jìn)RA進(jìn)展
實(shí)驗(yàn)證實(shí)NFATc2在RA患者FLSs和滑膜組織中表達(dá)升高，且去磷酸化活化和核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)。通過shRNA敲低NFATc2表達(dá)后，RA-FLSs的遷移侵襲能力顯著減弱。在SCID小鼠共植入模型中，敲低NFATc2的RA-FLSs軟骨侵蝕能力降低。在CIA小鼠模型中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射LV-shNFATc2慢病毒可減輕關(guān)節(jié)腫脹和組織病理評分。FLS特異性NFATc2敲除小鼠在CAIA模型中關(guān)節(jié)炎癥狀明顯改善。RNA-seq分析顯示，敲低NFATc2后MMP9、MMP13和IL-6等軟骨破壞和炎癥相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。
圖2 運(yùn)用CUT & Tag與RNA-seq技術(shù)篩選H3K9乳酸化修飾在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中調(diào)控的靶基因
乳酸依賴性H3K9la增強(qiáng)NFATc2表達(dá)
通過干擾乳酸脫氫酶（LDH）表達(dá)或活性（使用抑制劑FX-11），細(xì)胞內(nèi)乳酸產(chǎn)生減少導(dǎo)致H3K9la水平下降，NFATc2表達(dá)降低，RA-FLSs遷移侵襲能力減弱。另一方面，細(xì)胞外乳酸通過單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（MCT1）進(jìn)入細(xì)胞，乳酸干預(yù)可增加H3K9la水平和NFATc2表達(dá)，促進(jìn)FLS遷移和細(xì)胞因子分泌，而MCT1抑制劑AZD-3965可阻斷這些效應(yīng)。
靶向H3K9la減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎進(jìn)展
在CIA小鼠模型中，F(xiàn)X-11或AZD-3965處理組關(guān)節(jié)腫脹程度較輕，關(guān)節(jié)炎評分較低，軟骨破壞改善，組織學(xué)評分降低。免疫熒光顯示FX-11或AZD-3965治療降低了滑膜組織中H3K9la水平和NFATc2表達(dá)。同時，治療組血清中促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）濃度降低，抗炎細(xì)胞因子IL-10濃度升高。與甲氨蝶呤（MTX）聯(lián)合治療后，關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)一步改善。
RA患者血清中存在特異性識別乳酸化組蛋白的自身抗體
研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清中存在抗乳酸化組蛋白自身抗體，包括抗H2B、H3和H4乳酸化抗體。ELISA檢測顯示RA患者抗乳酸化組蛋白自身抗體水平顯著高于HC和銀屑病關(guān)節(jié)炎（PsA）患者，其中抗H3K9la抗體與DAS28評分呈正相關(guān)，且在高活動度RA患者中水平更高?？笻3K9la抗體在血清陽性和血清陰性RA患者中均存在，與抗CCP抗體水平無相關(guān)性。
研究結(jié)論與意義
本研究首次系統(tǒng)揭示了組蛋白乳酸化修飾在RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用：RA關(guān)節(jié)高乳酸微環(huán)境通過促進(jìn)組蛋白H3K9乳酸化修飾，轉(zhuǎn)錄上調(diào)NFATc2表達(dá)，增強(qiáng)FLSs的遷移侵襲能力，從而推動關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。同時發(fā)現(xiàn)的抗乳酸化組蛋白自身抗體為RA診斷提供了新的血清學(xué)標(biāo)志物。
該研究的重要意義在于：從表觀遺傳學(xué)角度揭示了乳酸代謝物在RA中的新型調(diào)控機(jī)制；鑒定NFATc2作為H3K9la的下游關(guān)鍵效應(yīng)分子，為RA治療提供了潛在靶點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)抗乳酸化組蛋白自身抗體與疾病活動度的相關(guān)性，為RA診斷和病情評估提供了新指標(biāo)；通過抑制乳酸產(chǎn)生（FX-11）和攝?。ˋZD-3965）可減輕關(guān)節(jié)炎癥狀，為RA治療提供了新的策略思路。
這項(xiàng)研究不僅深化了對RA發(fā)病機(jī)制的理解，也為開發(fā)針對代謝-表觀遺傳軸的新型治療方法和診斷工具奠定了重要基礎(chǔ)，具有顯著的臨床轉(zhuǎn)化潛力。
參考資料
[1] Histone lactylation promotes rheumatoid arthritis progression by increasing NFATc2 expression and the production of anti-lactylated histone autoantibodies
摘要：本研究揭示了組蛋白H3K9乳酸化（H3K9la）通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控NFATc2表達(dá)促進(jìn)纖維樣滑膜細(xì)胞（FLSs）遷移侵襲的新機(jī)制。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一種以慢性滑膜炎、自身抗體產(chǎn)生和關(guān)節(jié)骨破壞為特征的自身免疫性疾病。在RA患者的關(guān)節(jié)微環(huán)境中，缺氧和代謝重編程導(dǎo)致乳酸大量積累，形成高乳酸微環(huán)境。雖然既往研究提示乳酸可能參與RA進(jìn)展，但其具體分子機(jī)制始終不明。近年來，乳酸被發(fā)現(xiàn)在腫瘤免疫等領(lǐng)域作為信號分子發(fā)揮重要調(diào)控作用，特別是組蛋白乳酸化作為一種新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在多種疾病中被證實(shí)具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。然而，組蛋白乳酸化是否在RA發(fā)病過程中發(fā)揮作用，以及是否參與自身抗體的產(chǎn)生，仍有待深入探索。
溫州醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》發(fā)表的最新研究，首次系統(tǒng)揭示了組蛋白乳酸化修飾在RA疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。研究人員通過整合多組學(xué)分析、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和動物模型驗(yàn)證，闡明了乳酸依賴性組蛋白修飾調(diào)控纖維樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like Synoviocytes, FLSs）致病性的新機(jī)制，并為RA診斷提供了新型血清學(xué)標(biāo)志物。
圖1 組蛋白乳酸化通過增加NFATc2表達(dá)及抗乳酸化組蛋白自身抗體產(chǎn)生促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)展
研究采用的主要技術(shù)方法包括：Western blot和免疫熒光檢測組蛋白乳酸化水平；CUT&Tag技術(shù)（切割標(biāo)簽技術(shù)）聯(lián)合RNA測序篩選H3K9la靶基因；染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP-qPCR）驗(yàn)證組蛋白修飾與基因啟動子結(jié)合；利用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）和膠原抗體誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CAIA）小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)功能驗(yàn)證；ELISA檢測血清自身抗體水平。所有人類樣本均來源于未經(jīng)疾病修飾抗風(fēng)濕藥（DMARDs）治療的新診斷RA患者。
研究結(jié)果
組蛋白H3K9乳酸化在RA患者滑膜組織中顯著升高
研究人員首先發(fā)現(xiàn)RA患者FLSs中全局乳酸化水平顯著高于健康對照（HC）和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）患者，且乳酸化蛋白富集于分子量15kDa的核內(nèi)蛋白。通過pH對照實(shí)驗(yàn)排除酸性環(huán)境干擾，證實(shí)乳酸鈉和乳酸處理均可特異性增強(qiáng)FLSs的乳酸化修飾。進(jìn)一步針對8個已知組蛋白乳酸化位點(diǎn)的檢測顯示，H3K9la在RA患者FLSs和滑膜組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且乳酸處理可明顯促進(jìn)H3K9la水平。
NFATc2被篩選確認(rèn)為H3K9la的關(guān)鍵靶基因
通過CUT&Tag技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，H3K9la在RA-FLSs中更多富集于基因啟動子區(qū)域，且結(jié)合基序與HC存在差異（RA中為"GKACTGTA"，HC中為"SKGTATAC"）。KEGG通路分析顯示H3K9la結(jié)合基因顯著富集于"類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎"通路。整合RNA-seq數(shù)據(jù)篩選出68個同時存在H3K9la高結(jié)合且表達(dá)上調(diào)的靶基因，其中7個基因與"細(xì)胞運(yùn)動性"功能相關(guān)。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)NFATc2和IL12A啟動子區(qū)域存在H3K9la結(jié)合基序，且NFATc2表達(dá)差異最顯著。ChIP-qPCR證實(shí)H3K9la在NFATc2啟動子區(qū)域高度富集，RT-qPCR驗(yàn)證NFATc2在RA-FLSs中表達(dá)上調(diào)。
NFATc2過表達(dá)通過增強(qiáng)FLS遷移侵襲促進(jìn)RA進(jìn)展
實(shí)驗(yàn)證實(shí)NFATc2在RA患者FLSs和滑膜組織中表達(dá)升高，且去磷酸化活化和核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)。通過shRNA敲低NFATc2表達(dá)后，RA-FLSs的遷移侵襲能力顯著減弱。在SCID小鼠共植入模型中，敲低NFATc2的RA-FLSs軟骨侵蝕能力降低。在CIA小鼠模型中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射LV-shNFATc2慢病毒可減輕關(guān)節(jié)腫脹和組織病理評分。FLS特異性NFATc2敲除小鼠在CAIA模型中關(guān)節(jié)炎癥狀明顯改善。RNA-seq分析顯示，敲低NFATc2后MMP9、MMP13和IL-6等軟骨破壞和炎癥相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。
圖2 運(yùn)用CUT & Tag與RNA-seq技術(shù)篩選H3K9乳酸化修飾在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中調(diào)控的靶基因
乳酸依賴性H3K9la增強(qiáng)NFATc2表達(dá)
通過干擾乳酸脫氫酶（LDH）表達(dá)或活性（使用抑制劑FX-11），細(xì)胞內(nèi)乳酸產(chǎn)生減少導(dǎo)致H3K9la水平下降，NFATc2表達(dá)降低，RA-FLSs遷移侵襲能力減弱。另一方面，細(xì)胞外乳酸通過單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（MCT1）進(jìn)入細(xì)胞，乳酸干預(yù)可增加H3K9la水平和NFATc2表達(dá)，促進(jìn)FLS遷移和細(xì)胞因子分泌，而MCT1抑制劑AZD-3965可阻斷這些效應(yīng)。
靶向H3K9la減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎進(jìn)展
在CIA小鼠模型中，F(xiàn)X-11或AZD-3965處理組關(guān)節(jié)腫脹程度較輕，關(guān)節(jié)炎評分較低，軟骨破壞改善，組織學(xué)評分降低。免疫熒光顯示FX-11或AZD-3965治療降低了滑膜組織中H3K9la水平和NFATc2表達(dá)。同時，治療組血清中促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）濃度降低，抗炎細(xì)胞因子IL-10濃度升高。與甲氨蝶呤（MTX）聯(lián)合治療后，關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)一步改善。
RA患者血清中存在特異性識別乳酸化組蛋白的自身抗體
研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清中存在抗乳酸化組蛋白自身抗體，包括抗H2B、H3和H4乳酸化抗體。ELISA檢測顯示RA患者抗乳酸化組蛋白自身抗體水平顯著高于HC和銀屑病關(guān)節(jié)炎（PsA）患者，其中抗H3K9la抗體與DAS28評分呈正相關(guān)，且在高活動度RA患者中水平更高?？笻3K9la抗體在血清陽性和血清陰性RA患者中均存在，與抗CCP抗體水平無相關(guān)性。
研究結(jié)論與意義
本研究首次系統(tǒng)揭示了組蛋白乳酸化修飾在RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用：RA關(guān)節(jié)高乳酸微環(huán)境通過促進(jìn)組蛋白H3K9乳酸化修飾，轉(zhuǎn)錄上調(diào)NFATc2表達(dá)，增強(qiáng)FLSs的遷移侵襲能力，從而推動關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。同時發(fā)現(xiàn)的抗乳酸化組蛋白自身抗體為RA診斷提供了新的血清學(xué)標(biāo)志物。
該研究的重要意義在于：從表觀遺傳學(xué)角度揭示了乳酸代謝物在RA中的新型調(diào)控機(jī)制；鑒定NFATc2作為H3K9la的下游關(guān)鍵效應(yīng)分子，為RA治療提供了潛在靶點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)抗乳酸化組蛋白自身抗體與疾病活動度的相關(guān)性，為RA診斷和病情評估提供了新指標(biāo)；通過抑制乳酸產(chǎn)生（FX-11）和攝?。ˋZD-3965）可減輕關(guān)節(jié)炎癥狀，為RA治療提供了新的策略思路。
這項(xiàng)研究不僅深化了對RA發(fā)病機(jī)制的理解，也為開發(fā)針對代謝-表觀遺傳軸的新型治療方法和診斷工具奠定了重要基礎(chǔ)，具有顯著的臨床轉(zhuǎn)化潛力。
參考資料
[1] Histone lactylation promotes rheumatoid arthritis progression by increasing NFATc2 expression and the production of anti-lactylated histone autoantibodies
