摘要：研究聚焦慢性腎臟病(CKD)中足細胞衰老的關鍵難題，揭示了血管緊張素II(Ang II)通過轉錄因子FOXA1下調磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，導致L-絲氨酸合成減少、線粒體功能障礙和細胞衰老的新機制。
在腎臟的微觀世界里，足細胞如同精巧的支架，支撐著腎小球的濾過屏障。這些高度分化的細胞一旦受損，就會引發(fā)蛋白質泄漏，最終導致慢性腎臟病(CKD)的進展。其中，血管緊張素II(Ang II)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的核心成員，早已被證實是加速腎損傷的“罪魁禍首”。然而，科學家們一直困惑的是，Ang II究竟通過怎樣的精細機制，促使足細胞邁入衰老的深淵？以往的研究多聚焦于能量代謝紊亂，尤其是糖酵解的抑制，但僅僅恢復部分糖酵解通路并不能完全逆轉損傷，暗示著背后還隱藏著更深的代謝秘密。
近期，發(fā)表在《Nature Communications》上的一項研究揭開了這層神秘面紗。武漢大學人民醫(yī)院丁國華教授團隊發(fā)現(xiàn)，糖酵解通路中的一個關鍵酶——磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，其功能失調導致的L-絲氨酸合成不足，竟是驅動足細胞衰老的核心環(huán)節(jié)。這條名為“PGK1-絲氨酸-脫氧鞘脂”的代謝軸，為理解腎臟衰老提供了全新視角，也為干預CKD帶來了希望。
圖1 糖酵解途徑受損所致的絲氨酸代謝紊亂是足細胞衰老性損傷的關鍵驅動因素
研究人員綜合運用了多種關鍵技術方法開展此項研究。這包括：利用Ang II誘導的高血壓腎病(HN)小鼠模型、db/db 2型糖尿病腎病(DKD)小鼠模型和阿霉素(ADR)誘導的腎病小鼠模型進行在體功能驗證；通過人腎活檢組織（來源注明：武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會批準，包括健康對照和HN患者樣本）進行免疫組化、免疫熒光和臨床相關性分析；采用體外培養(yǎng)的永生化人足細胞(HPC)、小鼠足細胞(MPC-5)及原代足細胞模型進行機制探索；運用CRISPR/Cas9技術構建PGK1+/-基因敲低細胞系，并通過腺相關病毒(AAV)介導的基因操作實現(xiàn)足細胞特異性PGK1過表達(PGK1podKI)和敲除(PGK1podKO)小鼠模型；通過代謝組學（包括非靶向代謝組學、氨基酸代謝組學和脂質組學）和轉錄組學(RNA-seq)進行全局性分子圖譜分析；采用海馬能量代謝分析系統(tǒng)檢測細胞耗氧率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)；利用表面等離子共振(SPR)、細胞熱位移分析(CETSA)、藥物親和反應靶點穩(wěn)定性(DARTS)和分子對接等技術驗證蛋白質-小分子直接相互作用；通過免疫共沉淀(Co-IP)和鄰近連接技術(PLA)驗證蛋白質-蛋白質相互作用。
Ang II誘導絲氨酸缺乏、足細胞損傷和細胞衰老
研究人員首先確認Ang II會破壞足細胞的糖酵解過程，并發(fā)現(xiàn)多種損傷刺激（高糖、Ang II、ADR）均導致足細胞內的絲氨酸水平顯著下降。補充絲氨酸能有效改善線粒體形態(tài)和功能（如膜電位、ATP產(chǎn)量），減輕細胞骨架紊亂和脂質積聚，并顯著降低衰老相關β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性及衰老相關分泌表型(SASP)因子IL-1β和IL-6的分泌。這表明絲氨酸缺乏是Ang II誘導足細胞衰老的關鍵因素。
絲氨酸通過PI3K/AKT通路調控足細胞中脫氧鞘脂的產(chǎn)生
在機制探索中，研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸缺乏會顯著改變足細胞的整體代謝譜，其中脂質代謝，尤其是鞘脂生物合成通路變化最為顯著。具體表現(xiàn)為毒性脫氧鞘脂（如1-脫氧鞘氨醇(DeoxySA)、脫氧二氫神經(jīng)酰胺(DeoxyDHCer)和脫氧神經(jīng)酰胺(DeoxyCer)）的積聚。這些脫氧鞘脂會以劑量依賴的方式加劇細胞骨架紊亂和細胞衰老。進一步的機制研究表明，絲氨酸能直接與PI3K的Thr462位點結合并增強其激酶活性，從而激活PI3K/AKT信號通路。使用PI3K激動劑740Y-P可以模擬絲氨酸的保護作用，緩解脫氧鞘脂積聚和細胞衰老。
PGK1表達在Ang II誘導的足細胞損傷中下調
絲氨酸的從頭合成依賴于糖酵解中間產(chǎn)物3-磷酸甘油酸(3-PG)，而PGK1正是催化1,3-二磷酸甘油酸(1,3-BPG)生成3-PG的關鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，在HN患者腎組織及Ang II處理的足細胞中，PGK1的mRNA和蛋白水平均顯著下調。臨床數(shù)據(jù)分析顯示，較低的PGK1表達與更嚴重的蛋白尿、更高的尿白蛋白/肌酐比值(ACR)、更低的估算腎小球濾過率(eGFR)和更差的預后相關。
PGK1調控足細胞中的PI3K/AKT通路并與脫氧鞘脂積聚和細胞衰老相關
利用穩(wěn)定同位素13C6-D-葡萄糖標記技術，研究證實敲低PGK1確實會減少絲氨酸的合成，并影響三羧酸(TCA)循環(huán)。PGK1敲低還導致線粒體功能受損、細胞骨架紊亂、衰老標志物（p21, 8-OHdG）表達上調，并引起代謝組和轉錄組的顯著改變，其中鞘脂代謝和PI3K/AKT通路富集程度最高。而過表達PGK1則能逆轉上述病理變化。
PGK1穩(wěn)定KRT1
除了酶活性功能，研究還發(fā)現(xiàn)PGK1具有非酶功能。通過蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)PGK1與細胞角蛋白II型骨架1(KRT1)存在相互作用。實驗證實PGK1并不影響KRT1的mRNA表達，但能通過與KRT1蛋白結合，延緩其被蛋白酶體降解，從而起到穩(wěn)定KRT1、維持細胞骨架完整性的作用。功能域突變實驗進一步揭示，PGK1通過其K131和T168位點發(fā)揮酶活性調控絲氨酸代謝，而其200-360氨基酸區(qū)域則負責與KRT1結合，后者以不依賴酶活性的方式參與調控細胞衰老。
足細胞特異性過表達PGK1可減輕Ang II誘導的小鼠模型中的足細胞衰老
為了在體驗證PGK1的功能，研究者構建了足細胞特異性過表達PGK1的小鼠(PGK1podKI)。在Ang II刺激下，PGK1podKI小鼠表現(xiàn)出更輕的腎功能損傷（較低的ACR、BUN、Cr）、更完整的足細胞結構（WT1, SYNPO染色）、改善的線粒體呼吸功能，以及顯著減輕的衰老標志物表達和脫氧鞘脂積聚。通過AAV在成年小鼠腎臟原位過表達PGK1也能取得類似保護效果。
足細胞特異性敲除PGK1加劇Ang II誘導的小鼠模型中的足細胞衰老
相反，足細胞特異性敲除PGK1的小鼠(PGK1podKO)在Ang II刺激下，腎臟損傷和足細胞衰老表型均顯著加劇。使用PGK1特異性抑制劑Z57346765處理正常小鼠，也能重現(xiàn)Ang II加重足細胞衰老的效果，進一步證實了PGK1的關鍵保護作用。
FOXA1調控PGK1轉錄并在Ang II誘導的足細胞衰老中起保護作用
轉錄因子FOXA1能直接結合到PGK1基因的啟動子區(qū)域并促進其轉錄。在HN患者和Ang II處理的小鼠足細胞中，F(xiàn)OXA1的表達同樣下調。在足細胞中過表達FOXA1能部分依賴PGK1，緩解Ang II誘導的PI3K/AKT通路抑制、足細胞衰老和腎小球病理損傷。
補充絲氨酸可減輕Ang II誘導的小鼠模型中的足細胞衰老
究驗證了補充L-絲氨酸的治療潛力。在Ang II誘導的CKD小鼠模型中，口服補充絲氨酸能有效恢復腎臟功能，改善腎小球結構和足細胞超微結構，增強線粒體功能，激活PI3K/AKT通路，并降低衰老標志物和脫氧鞘脂水平。更重要的是，在db/db DKD小鼠和ADR腎病模型這兩種非Ang II誘導的CKD模型中，絲氨酸補充同樣顯示出保護作用，提示其治療策略具有廣譜潛力。
綜上所述，本研究系統(tǒng)闡明了一條全新的信號軸：Ang II通過抑制轉錄因子FOXA1，下調足細胞中PGK1的表達，導致糖酵解來源的L-絲氨酸合成減少。絲氨酸缺乏一方面無法通過激活PI3K/AKT通路來抑制毒性脫氧鞘脂的生成，另一方面PGK1減少也削弱了其穩(wěn)定KRT1以維持細胞骨架的能力，共同推動了足細胞的衰老進程。這項研究不僅深化了對足細胞損傷機制的理解，更重要的是將PGK1和絲氨酸代謝推向了CKD治療干預的潛在靶點位置。通過補充絲氨酸或靶向增強PGK1活性來重塑足細胞代謝穩(wěn)態(tài)，有望為延緩腎臟衰老、遏制CKD進展開辟新的治療途徑。
參考資料
[1] Impaired glycolysis-derived serine metabolism as a key driver of podocyte injury with senescence
摘要：研究聚焦慢性腎臟病(CKD)中足細胞衰老的關鍵難題，揭示了血管緊張素II(Ang II)通過轉錄因子FOXA1下調磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，導致L-絲氨酸合成減少、線粒體功能障礙和細胞衰老的新機制。
在腎臟的微觀世界里，足細胞如同精巧的支架，支撐著腎小球的濾過屏障。這些高度分化的細胞一旦受損，就會引發(fā)蛋白質泄漏，最終導致慢性腎臟病(CKD)的進展。其中，血管緊張素II(Ang II)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的核心成員，早已被證實是加速腎損傷的“罪魁禍首”。然而，科學家們一直困惑的是，Ang II究竟通過怎樣的精細機制，促使足細胞邁入衰老的深淵？以往的研究多聚焦于能量代謝紊亂，尤其是糖酵解的抑制，但僅僅恢復部分糖酵解通路并不能完全逆轉損傷，暗示著背后還隱藏著更深的代謝秘密。
近期，發(fā)表在《Nature Communications》上的一項研究揭開了這層神秘面紗。武漢大學人民醫(yī)院丁國華教授團隊發(fā)現(xiàn)，糖酵解通路中的一個關鍵酶——磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，其功能失調導致的L-絲氨酸合成不足，竟是驅動足細胞衰老的核心環(huán)節(jié)。這條名為“PGK1-絲氨酸-脫氧鞘脂”的代謝軸，為理解腎臟衰老提供了全新視角，也為干預CKD帶來了希望。
圖1 糖酵解途徑受損所致的絲氨酸代謝紊亂是足細胞衰老性損傷的關鍵驅動因素
研究人員綜合運用了多種關鍵技術方法開展此項研究。這包括：利用Ang II誘導的高血壓腎病(HN)小鼠模型、db/db 2型糖尿病腎病(DKD)小鼠模型和阿霉素(ADR)誘導的腎病小鼠模型進行在體功能驗證；通過人腎活檢組織（來源注明：武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會批準，包括健康對照和HN患者樣本）進行免疫組化、免疫熒光和臨床相關性分析；采用體外培養(yǎng)的永生化人足細胞(HPC)、小鼠足細胞(MPC-5)及原代足細胞模型進行機制探索；運用CRISPR/Cas9技術構建PGK1+/-基因敲低細胞系，并通過腺相關病毒(AAV)介導的基因操作實現(xiàn)足細胞特異性PGK1過表達(PGK1podKI)和敲除(PGK1podKO)小鼠模型；通過代謝組學（包括非靶向代謝組學、氨基酸代謝組學和脂質組學）和轉錄組學(RNA-seq)進行全局性分子圖譜分析；采用海馬能量代謝分析系統(tǒng)檢測細胞耗氧率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)；利用表面等離子共振(SPR)、細胞熱位移分析(CETSA)、藥物親和反應靶點穩(wěn)定性(DARTS)和分子對接等技術驗證蛋白質-小分子直接相互作用；通過免疫共沉淀(Co-IP)和鄰近連接技術(PLA)驗證蛋白質-蛋白質相互作用。
Ang II誘導絲氨酸缺乏、足細胞損傷和細胞衰老
研究人員首先確認Ang II會破壞足細胞的糖酵解過程，并發(fā)現(xiàn)多種損傷刺激（高糖、Ang II、ADR）均導致足細胞內的絲氨酸水平顯著下降。補充絲氨酸能有效改善線粒體形態(tài)和功能（如膜電位、ATP產(chǎn)量），減輕細胞骨架紊亂和脂質積聚，并顯著降低衰老相關β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性及衰老相關分泌表型(SASP)因子IL-1β和IL-6的分泌。這表明絲氨酸缺乏是Ang II誘導足細胞衰老的關鍵因素。
絲氨酸通過PI3K/AKT通路調控足細胞中脫氧鞘脂的產(chǎn)生
在機制探索中，研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸缺乏會顯著改變足細胞的整體代謝譜，其中脂質代謝，尤其是鞘脂生物合成通路變化最為顯著。具體表現(xiàn)為毒性脫氧鞘脂（如1-脫氧鞘氨醇(DeoxySA)、脫氧二氫神經(jīng)酰胺(DeoxyDHCer)和脫氧神經(jīng)酰胺(DeoxyCer)）的積聚。這些脫氧鞘脂會以劑量依賴的方式加劇細胞骨架紊亂和細胞衰老。進一步的機制研究表明，絲氨酸能直接與PI3K的Thr462位點結合并增強其激酶活性，從而激活PI3K/AKT信號通路。使用PI3K激動劑740Y-P可以模擬絲氨酸的保護作用，緩解脫氧鞘脂積聚和細胞衰老。
PGK1表達在Ang II誘導的足細胞損傷中下調
絲氨酸的從頭合成依賴于糖酵解中間產(chǎn)物3-磷酸甘油酸(3-PG)，而PGK1正是催化1,3-二磷酸甘油酸(1,3-BPG)生成3-PG的關鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，在HN患者腎組織及Ang II處理的足細胞中，PGK1的mRNA和蛋白水平均顯著下調。臨床數(shù)據(jù)分析顯示，較低的PGK1表達與更嚴重的蛋白尿、更高的尿白蛋白/肌酐比值(ACR)、更低的估算腎小球濾過率(eGFR)和更差的預后相關。
PGK1調控足細胞中的PI3K/AKT通路并與脫氧鞘脂積聚和細胞衰老相關
利用穩(wěn)定同位素13C6-D-葡萄糖標記技術，研究證實敲低PGK1確實會減少絲氨酸的合成，并影響三羧酸(TCA)循環(huán)。PGK1敲低還導致線粒體功能受損、細胞骨架紊亂、衰老標志物（p21, 8-OHdG）表達上調，并引起代謝組和轉錄組的顯著改變，其中鞘脂代謝和PI3K/AKT通路富集程度最高。而過表達PGK1則能逆轉上述病理變化。
PGK1穩(wěn)定KRT1
除了酶活性功能，研究還發(fā)現(xiàn)PGK1具有非酶功能。通過蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)PGK1與細胞角蛋白II型骨架1(KRT1)存在相互作用。實驗證實PGK1并不影響KRT1的mRNA表達，但能通過與KRT1蛋白結合，延緩其被蛋白酶體降解，從而起到穩(wěn)定KRT1、維持細胞骨架完整性的作用。功能域突變實驗進一步揭示，PGK1通過其K131和T168位點發(fā)揮酶活性調控絲氨酸代謝，而其200-360氨基酸區(qū)域則負責與KRT1結合，后者以不依賴酶活性的方式參與調控細胞衰老。
足細胞特異性過表達PGK1可減輕Ang II誘導的小鼠模型中的足細胞衰老
為了在體驗證PGK1的功能，研究者構建了足細胞特異性過表達PGK1的小鼠(PGK1podKI)。在Ang II刺激下，PGK1podKI小鼠表現(xiàn)出更輕的腎功能損傷（較低的ACR、BUN、Cr）、更完整的足細胞結構（WT1, SYNPO染色）、改善的線粒體呼吸功能，以及顯著減輕的衰老標志物表達和脫氧鞘脂積聚。通過AAV在成年小鼠腎臟原位過表達PGK1也能取得類似保護效果。
足細胞特異性敲除PGK1加劇Ang II誘導的小鼠模型中的足細胞衰老
相反，足細胞特異性敲除PGK1的小鼠(PGK1podKO)在Ang II刺激下，腎臟損傷和足細胞衰老表型均顯著加劇。使用PGK1特異性抑制劑Z57346765處理正常小鼠，也能重現(xiàn)Ang II加重足細胞衰老的效果，進一步證實了PGK1的關鍵保護作用。
FOXA1調控PGK1轉錄并在Ang II誘導的足細胞衰老中起保護作用
轉錄因子FOXA1能直接結合到PGK1基因的啟動子區(qū)域并促進其轉錄。在HN患者和Ang II處理的小鼠足細胞中，F(xiàn)OXA1的表達同樣下調。在足細胞中過表達FOXA1能部分依賴PGK1，緩解Ang II誘導的PI3K/AKT通路抑制、足細胞衰老和腎小球病理損傷。
補充絲氨酸可減輕Ang II誘導的小鼠模型中的足細胞衰老
究驗證了補充L-絲氨酸的治療潛力。在Ang II誘導的CKD小鼠模型中，口服補充絲氨酸能有效恢復腎臟功能，改善腎小球結構和足細胞超微結構，增強線粒體功能，激活PI3K/AKT通路，并降低衰老標志物和脫氧鞘脂水平。更重要的是，在db/db DKD小鼠和ADR腎病模型這兩種非Ang II誘導的CKD模型中，絲氨酸補充同樣顯示出保護作用，提示其治療策略具有廣譜潛力。
綜上所述，本研究系統(tǒng)闡明了一條全新的信號軸：Ang II通過抑制轉錄因子FOXA1，下調足細胞中PGK1的表達，導致糖酵解來源的L-絲氨酸合成減少。絲氨酸缺乏一方面無法通過激活PI3K/AKT通路來抑制毒性脫氧鞘脂的生成，另一方面PGK1減少也削弱了其穩(wěn)定KRT1以維持細胞骨架的能力，共同推動了足細胞的衰老進程。這項研究不僅深化了對足細胞損傷機制的理解，更重要的是將PGK1和絲氨酸代謝推向了CKD治療干預的潛在靶點位置。通過補充絲氨酸或靶向增強PGK1活性來重塑足細胞代謝穩(wěn)態(tài)，有望為延緩腎臟衰老、遏制CKD進展開辟新的治療途徑。
參考資料
[1] Impaired glycolysis-derived serine metabolism as a key driver of podocyte injury with senescence
