分選酶A（Sortase A）是革蘭氏陽(yáng)性菌分泌的一類膜結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶，其核心功能是：它能精準(zhǔn)識(shí)別特定氨基酸序列（LPXTG），在蘇氨酸（T）和甘氨酸（G）之間切割，隨后將蛋白的C端與細(xì)胞壁肽聚糖的氨基通過酰胺鍵共價(jià)連接，完成錨定，像“分子裁縫”一樣催化共價(jià)連接，既保證了連接的特異性，又不破壞生物分子活性。
Seebio?分選酶 A 是在野生型分選酶 A 基礎(chǔ)上，經(jīng)進(jìn)化突變，優(yōu)化篩選獲得。該酶的核心特點(diǎn)是“活性高、底物親和力強(qiáng)、特異性保留、應(yīng)用場(chǎng)景廣”--既解決了野生型分選酶A需高酶量/高底物濃度/長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)的痛點(diǎn)，又實(shí)現(xiàn)了低濃度LPETG場(chǎng)景的高效催化，為生物偶聯(lián)（如細(xì)胞表面蛋白標(biāo)記、ADC定點(diǎn)偶聯(lián)、蛋白固定化）提供了更實(shí)用的工具酶。
Seebio?分選酶A催化活性較野生型提升明顯
Seebio?分選酶A的底物識(shí)別與周轉(zhuǎn)效率顯著改善
動(dòng)力學(xué)指標(biāo) | 野生型 | Seebio?分選酶A | 關(guān)鍵差異 |
周轉(zhuǎn)率(κcat) | 1.5±0.2s-1 | 4.8±0.8s-1 | 提升3倍，催化反應(yīng)速率提高 |
LPETG結(jié)合(κmLPETG) | 7.6±0.5mM | 0.17±0.03mM | 降低45倍，對(duì)LPETG親和力增強(qiáng) |
GGG結(jié)合(κmGGG) | 140±30μM | 4800±700μM | 升高34倍，對(duì)GGG的親和力下降 |
一、ADC藥物開發(fā)
分選酶A可以識(shí)別LPXTG氨基酸序列，將T-G間肽鍵斷裂形成LPXT-SrtA，含親核oligo-G的分子進(jìn)入重構(gòu)形成新的肽鍵，相較于傳統(tǒng)化學(xué)偶聯(lián)的ADC藥物，藥物抗體比率（DAR）通常為0-8，導(dǎo)致療效不穩(wěn)定、毒副作用強(qiáng)。分選酶介導(dǎo)的連接更加精準(zhǔn)快捷，使DAR值固定為2或4，從源頭解決異質(zhì)性問題。
如阿斯利康在研發(fā)靶向HER2的ADC藥物時(shí)，采用分選酶A五突變體（催化活性較野生型提升50倍），實(shí)現(xiàn)毒素與曲妥珠單抗的定點(diǎn)偶聯(lián)，產(chǎn)物DAR均一率達(dá)98%，臨床前試驗(yàn)中腫瘤抑制率較傳統(tǒng)ADC提升30%，且血液毒性顯著降低[1]
二、酶工程改造
通過分選酶催化，可將單個(gè)酶分子連接成多聚體（如二聚體、四聚體），提升酶的催化效率和熱穩(wěn)定性；或使線形蛋白環(huán)化，減少蛋白酶水解，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。
江南大學(xué)團(tuán)隊(duì)在(S)-羰基還原酶的C端添加GGGGSLPETGG序列，經(jīng)分選酶A催化形成二聚體，改造后的酶比酶活提升3.2倍，熱穩(wěn)定性提高15℃，用于不對(duì)稱還原合成手性醇時(shí)反應(yīng)時(shí)間大幅縮短，相關(guān)技術(shù)已獲國(guó)家專利授權(quán)并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。[2]
圖：Stereoviewof the overall model structure of enzyme-cofactor docking with NADPH (a) and NADH (b), respectively, illustrated by the PyMOL program.
三、蛋白質(zhì)功能研究
分選酶A可以識(shí)別底物結(jié)構(gòu)中的LPXTG基序，切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的肽鍵形成一個(gè)共價(jià)的?；?酶中間體，這個(gè)中間體被細(xì)胞表面的親核的N端3×甘氨酸殘基分解后，在細(xì)胞和底物之間形成肽鍵。
北京時(shí)間2023年9月4日，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高曉飛團(tuán)隊(duì)在Cell Research上在線發(fā)表研究論文。該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的紅細(xì)胞載藥平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了在紅細(xì)胞表面高效穩(wěn)定偶聯(lián)小分子和蛋白。其通過改造過的紅細(xì)胞平臺(tái)，并在紅細(xì)胞表面搭載pro-uPA以治療血栓性疾病。在體外和體內(nèi)的溶栓試驗(yàn)結(jié)果表明，與單純的pro-uPA蛋白相比，偶聯(lián)在紅細(xì)胞表面的pro-uPA更安全，并且其短期和長(zhǎng)期溶栓藥效都具有顯著優(yōu)勢(shì)。這項(xiàng)研究驗(yàn)證了紅細(xì)胞載藥的優(yōu)越性，為血栓性疾病的臨床治療提供了新方向。[3]
圖. Engineering RBCs with pro-uPA for dissolving thrombi
從實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究到產(chǎn)業(yè)界的規(guī)模化應(yīng)用，分選酶憑借其高特異性、高兼容性的優(yōu)勢(shì)，正在改寫生物醫(yī)藥、合成生物學(xué)等領(lǐng)域的技術(shù)格局。
產(chǎn)品訂購(gòu)
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 包裝規(guī)格 |
Seebio? 分選酶A（Sortase A） | ECE0720A-50μg | 50μg/支 |
Seebio? 分選酶A（Sortase A） | ECE0720A-100μg | 100μg/支 |
Seebio? 分選酶A（Sortase A） | ECE0720A-1mg | 1mg/支 |
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 包裝規(guī)格 |
Seebio? 重組煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEV酶） | EBY3644B | 5mg/10mg |
Seebio?TEV 蛋白酶（TEV Protease）活性測(cè)定試劑盒(熒光法) | EKM0101B | 50T |
SUMO 蛋白酶(凍干粉) | EAE0087A | 1mg |
重組腸激酶 | ECE1123A | 100U |
大腸桿菌表達(dá)重組腸激酶（不帶標(biāo)簽） | DAA1065A | 100U |
重組HRV 3C蛋白酶 | FCE1220A | 1KU |
參考文獻(xiàn)
【1】Stefan, Nikolas, et al."Highly potent, anthracycline-based antibody drug conjugates generated by enzymatic, site-specific conjugation." Molecular Cancer Therapeutics (2017):molcanther.0688.2016。
【2】Nie Y, Xiao R,, et al. Novel anti-Prelog stereospecific carbonyl reductases from Candida parapsilosis for asymmetric reduction of prochiral ketones. Org Biomol Chem. 2011 Jun 7;9(11):4070-8. doi: 10.1039/c0ob00938e.
【3】Huang, Y., Nie, X., Liu, X. et al. Development of a highly-efficient erythrocyte-drug covalent conjugation platform and its use in treating thrombotic disorders. Cell Res 33, 887-890 (2023). doi.org/10.1038/s41422-023-00868-2
分選酶A（Sortase A）是革蘭氏陽(yáng)性菌分泌的一類膜結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶，其核心功能是：它能精準(zhǔn)識(shí)別特定氨基酸序列（LPXTG），在蘇氨酸（T）和甘氨酸（G）之間切割，隨后將蛋白的C端與細(xì)胞壁肽聚糖的氨基通過酰胺鍵共價(jià)連接，完成錨定，像“分子裁縫”一樣催化共價(jià)連接，既保證了連接的特異性，又不破壞生物分子活性。
Seebio?分選酶 A 是在野生型分選酶 A 基礎(chǔ)上，經(jīng)進(jìn)化突變，優(yōu)化篩選獲得。該酶的核心特點(diǎn)是“活性高、底物親和力強(qiáng)、特異性保留、應(yīng)用場(chǎng)景廣”--既解決了野生型分選酶A需高酶量/高底物濃度/長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)的痛點(diǎn)，又實(shí)現(xiàn)了低濃度LPETG場(chǎng)景的高效催化，為生物偶聯(lián)（如細(xì)胞表面蛋白標(biāo)記、ADC定點(diǎn)偶聯(lián)、蛋白固定化）提供了更實(shí)用的工具酶。
Seebio?分選酶A催化活性較野生型提升明顯
Seebio?分選酶A的底物識(shí)別與周轉(zhuǎn)效率顯著改善
動(dòng)力學(xué)指標(biāo) | 野生型 | Seebio?分選酶A | 關(guān)鍵差異 |
周轉(zhuǎn)率(κcat) | 1.5±0.2s-1 | 4.8±0.8s-1 | 提升3倍，催化反應(yīng)速率提高 |
LPETG結(jié)合(κmLPETG) | 7.6±0.5mM | 0.17±0.03mM | 降低45倍，對(duì)LPETG親和力增強(qiáng) |
GGG結(jié)合(κmGGG) | 140±30μM | 4800±700μM | 升高34倍，對(duì)GGG的親和力下降 |
一、ADC藥物開發(fā)
分選酶A可以識(shí)別LPXTG氨基酸序列，將T-G間肽鍵斷裂形成LPXT-SrtA，含親核oligo-G的分子進(jìn)入重構(gòu)形成新的肽鍵，相較于傳統(tǒng)化學(xué)偶聯(lián)的ADC藥物，藥物抗體比率（DAR）通常為0-8，導(dǎo)致療效不穩(wěn)定、毒副作用強(qiáng)。分選酶介導(dǎo)的連接更加精準(zhǔn)快捷，使DAR值固定為2或4，從源頭解決異質(zhì)性問題。
如阿斯利康在研發(fā)靶向HER2的ADC藥物時(shí)，采用分選酶A五突變體（催化活性較野生型提升50倍），實(shí)現(xiàn)毒素與曲妥珠單抗的定點(diǎn)偶聯(lián)，產(chǎn)物DAR均一率達(dá)98%，臨床前試驗(yàn)中腫瘤抑制率較傳統(tǒng)ADC提升30%，且血液毒性顯著降低[1]
二、酶工程改造
通過分選酶催化，可將單個(gè)酶分子連接成多聚體（如二聚體、四聚體），提升酶的催化效率和熱穩(wěn)定性；或使線形蛋白環(huán)化，減少蛋白酶水解，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。
江南大學(xué)團(tuán)隊(duì)在(S)-羰基還原酶的C端添加GGGGSLPETGG序列，經(jīng)分選酶A催化形成二聚體，改造后的酶比酶活提升3.2倍，熱穩(wěn)定性提高15℃，用于不對(duì)稱還原合成手性醇時(shí)反應(yīng)時(shí)間大幅縮短，相關(guān)技術(shù)已獲國(guó)家專利授權(quán)并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。[2]
圖：Stereoviewof the overall model structure of enzyme-cofactor docking with NADPH (a) and NADH (b), respectively, illustrated by the PyMOL program.
三、蛋白質(zhì)功能研究
分選酶A可以識(shí)別底物結(jié)構(gòu)中的LPXTG基序，切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的肽鍵形成一個(gè)共價(jià)的?；?酶中間體，這個(gè)中間體被細(xì)胞表面的親核的N端3×甘氨酸殘基分解后，在細(xì)胞和底物之間形成肽鍵。
北京時(shí)間2023年9月4日，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高曉飛團(tuán)隊(duì)在Cell Research上在線發(fā)表研究論文。該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的紅細(xì)胞載藥平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了在紅細(xì)胞表面高效穩(wěn)定偶聯(lián)小分子和蛋白。其通過改造過的紅細(xì)胞平臺(tái)，并在紅細(xì)胞表面搭載pro-uPA以治療血栓性疾病。在體外和體內(nèi)的溶栓試驗(yàn)結(jié)果表明，與單純的pro-uPA蛋白相比，偶聯(lián)在紅細(xì)胞表面的pro-uPA更安全，并且其短期和長(zhǎng)期溶栓藥效都具有顯著優(yōu)勢(shì)。這項(xiàng)研究驗(yàn)證了紅細(xì)胞載藥的優(yōu)越性，為血栓性疾病的臨床治療提供了新方向。[3]
圖. Engineering RBCs with pro-uPA for dissolving thrombi
從實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究到產(chǎn)業(yè)界的規(guī)?；瘧?yīng)用，分選酶憑借其高特異性、高兼容性的優(yōu)勢(shì)，正在改寫生物醫(yī)藥、合成生物學(xué)等領(lǐng)域的技術(shù)格局。
產(chǎn)品訂購(gòu)
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 包裝規(guī)格 |
Seebio? 分選酶A（Sortase A） | ECE0720A-50μg | 50μg/支 |
Seebio? 分選酶A（Sortase A） | ECE0720A-100μg | 100μg/支 |
Seebio? 分選酶A（Sortase A） | ECE0720A-1mg | 1mg/支 |
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 包裝規(guī)格 |
Seebio? 重組煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEV酶） | EBY3644B | 5mg/10mg |
Seebio?TEV 蛋白酶（TEV Protease）活性測(cè)定試劑盒(熒光法) | EKM0101B | 50T |
SUMO 蛋白酶(凍干粉) | EAE0087A | 1mg |
重組腸激酶 | ECE1123A | 100U |
大腸桿菌表達(dá)重組腸激酶（不帶標(biāo)簽） | DAA1065A | 100U |
重組HRV 3C蛋白酶 | FCE1220A | 1KU |
參考文獻(xiàn)
【1】Stefan, Nikolas, et al."Highly potent, anthracycline-based antibody drug conjugates generated by enzymatic, site-specific conjugation." Molecular Cancer Therapeutics (2017):molcanther.0688.2016。
【2】Nie Y, Xiao R,, et al. Novel anti-Prelog stereospecific carbonyl reductases from Candida parapsilosis for asymmetric reduction of prochiral ketones. Org Biomol Chem. 2011 Jun 7;9(11):4070-8. doi: 10.1039/c0ob00938e.
【3】Huang, Y., Nie, X., Liu, X. et al. Development of a highly-efficient erythrocyte-drug covalent conjugation platform and its use in treating thrombotic disorders. Cell Res 33, 887-890 (2023). doi.org/10.1038/s41422-023-00868-2
