摘要：研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的LCN2通過SLC22A17/JAK2/STAT3通路激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，招募巨噬細(xì)胞。

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，而腦轉(zhuǎn)移（Brain Metastasis, BM）是導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因，發(fā)生率高達(dá)50%。盡管針對EGFR、ALK等驅(qū)動基因的靶向治療以及免疫治療和放療取得了顯著進(jìn)展，但肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍然極差。腦部獨(dú)特的微環(huán)境，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元等，在腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。然而，腫瘤細(xì)胞與腦部微環(huán)境細(xì)胞之間相互作用的分子機(jī)制尚不完全清楚，這限制了有效治療策略的開發(fā)。

為了闡明肺癌腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院等機(jī)構(gòu)的研究團(tuán)隊在《Signal Transduction and Targeted Therapy》雜志上發(fā)表了一項重要研究。該研究通過整合單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）、臨床樣本分析以及體內(nèi)外功能實驗，揭示了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2（Lipocalin-2, LCN2）在驅(qū)動肺癌腦轉(zhuǎn)移中的核心作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的LCN2通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和招募巨噬細(xì)胞，形成了一個促進(jìn)腫瘤生長的惡性循環(huán)，并同時通過自分泌方式促進(jìn)腫瘤血管生成。該研究不僅闡明了LCN2在腦轉(zhuǎn)移中的雙重驅(qū)動機(jī)制，還提出了靶向LCN2軸的治療新策略。

 圖1 脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2通過肺癌中腫瘤與微環(huán)境的相互作用驅(qū)動腦轉(zhuǎn)移進(jìn)展

關(guān)鍵技術(shù)方法

本研究綜合運(yùn)用了多種前沿技術(shù)手段。在臨床樣本分析方面，研究人員收集了肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的配對原發(fā)灶和腦轉(zhuǎn)移灶組織、血漿樣本以及單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)，并結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫（如GEO）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建上，研究團(tuán)隊通過左心室注射、頸動脈注射和顱內(nèi)原位注射等方法，成功建立了多種肺癌腦轉(zhuǎn)移小鼠模型。在機(jī)制探索方面，研究采用了基因敲低（shRNA）和過表達(dá)技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）、免疫共沉淀（Co-IP）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光（IF）和免疫組化（IHC）等分子生物學(xué)技術(shù)，并利用體外血腦屏障（BBB）模型、細(xì)胞共培養(yǎng)體系以及血管生成實驗，深入解析了LCN2在腫瘤-微環(huán)境互作中的功能。

研究結(jié)果

LCN2在肺癌腦轉(zhuǎn)移中高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)

為了尋找驅(qū)動肺癌腦轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，研究人員首先對配對的肺癌原發(fā)灶和腦轉(zhuǎn)移灶組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LCN2、NCAM1、S100B和SPP1這四個基因在腦轉(zhuǎn)移灶中一致性上調(diào)。通過單細(xì)胞RNA測序分析，研究人員進(jìn)一步確認(rèn)，在這四個候選基因中，只有LCN2主要在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并且在腦轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平顯著高于原發(fā)灶。這一發(fā)現(xiàn)在體外實驗中也得到了驗證，通過左心室注射構(gòu)建的腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（PC9-BM）中，LCN2的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于親本細(xì)胞（PC9）及其他轉(zhuǎn)移灶（如肺、肝）來源的細(xì)胞。臨床樣本分析顯示，在43對配對的患者樣本中，腦轉(zhuǎn)移灶的LCN2蛋白水平顯著高于原發(fā)灶。此外，高表達(dá)LCN2的腦轉(zhuǎn)移患者，其顱內(nèi)無病生存期（iDFS）顯著縮短。血漿檢測也發(fā)現(xiàn)，腦轉(zhuǎn)移患者的LCN2水平顯著高于健康對照和肝轉(zhuǎn)移患者。這些數(shù)據(jù)共同表明，LCN2在肺癌腦轉(zhuǎn)移中高表達(dá)，并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。

LCN2促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移灶的生長，但不影響血腦屏障的穿越

為了明確LCN2在腦轉(zhuǎn)移過程中的功能，研究人員在多種肺癌細(xì)胞系中進(jìn)行了LCN2的敲低和過表達(dá)操作。體外實驗發(fā)現(xiàn)，LCN2的敲低或過表達(dá)并不影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力，也不影響其穿越體外血腦屏障模型的能力。體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實，無論是通過左心室注射還是頸動脈注射，LCN2的敲低或過表達(dá)均不影響腫瘤細(xì)胞穿越血腦屏障進(jìn)入腦實質(zhì)。然而，一旦腫瘤細(xì)胞進(jìn)入腦實質(zhì)，LCN2的作用便顯現(xiàn)出來。通過顱內(nèi)原位注射實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)，敲低LCN2的PC9-BM細(xì)胞形成的腦內(nèi)腫瘤負(fù)荷顯著降低，而過表達(dá)LCN2的A549和TC1細(xì)胞則形成了更大的腦內(nèi)腫瘤，并導(dǎo)致荷瘤小鼠的生存期縮短。這些結(jié)果表明，LCN2對于腫瘤細(xì)胞穿越血腦屏障并非必需，但對于腫瘤細(xì)胞在腦微環(huán)境中的定植和生長至關(guān)重要。

LCN2通過JAK2/STAT3通路促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移灶的血管生成

為了探究LCN2促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移生長的機(jī)制，研究人員對LCN2高表達(dá)和低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了基因富集分析（GO analysis）。結(jié)果顯示，LCN2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，炎癥反應(yīng)和IL6-JAK-STAT3信號通路被顯著激活。通過細(xì)胞因子芯片和ELISA檢測，研究人員發(fā)現(xiàn)，LCN2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）水平顯著升高。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，LCN2通過結(jié)合其受體SLC22A17，激活了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的JAK2/STAT3信號通路，從而上調(diào)了VEGF-A的表達(dá)和分泌。功能實驗證實，LCN2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能夠顯著促進(jìn)腦內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力，而體內(nèi)實驗也顯示，LCN2高表達(dá)腫瘤形成的腦轉(zhuǎn)移灶中，微血管密度顯著增加。在治療方面，STAT3抑制劑SH4-54和抗VEGF-A抗體貝伐珠單抗（bevacizumab）均能有效抑制LCN2高表達(dá)腦轉(zhuǎn)移小鼠模型的腫瘤生長。這些結(jié)果揭示了LCN2通過激活腫瘤細(xì)胞自身的JAK2/STAT3通路，促進(jìn)VEGF-A介導(dǎo)的血管生成，從而驅(qū)動腦轉(zhuǎn)移灶的生長。

LCN2通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和招募巨噬細(xì)胞重塑腦轉(zhuǎn)移微環(huán)境

研究人員發(fā)現(xiàn)，LCN2對腫瘤生長的促進(jìn)作用具有腦部特異性，在皮下或肺原位腫瘤模型中，LCN2的敲低或過表達(dá)并不影響腫瘤的生長和血管密度。單細(xì)胞RNA測序分析顯示，腦轉(zhuǎn)移灶中富含神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，而這兩種細(xì)胞均高表達(dá)LCN2的受體SLC22A17。在LCN2高表達(dá)的腦轉(zhuǎn)移灶中，巨噬細(xì)胞的浸潤比例顯著增加，而星形膠質(zhì)細(xì)胞中與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用相關(guān)的通路被富集，特別是巨噬細(xì)胞趨化因子CCL2的表達(dá)上調(diào)。臨床樣本的免疫組化分析也證實，LCN2蛋白水平與巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的表達(dá)呈正相關(guān)。體外實驗進(jìn)一步證明，LCN2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后，能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移，而這一效應(yīng)依賴于星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的CCL2。這些結(jié)果表明，LCN2通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的招募，從而重塑了腦轉(zhuǎn)移微環(huán)境。

LCN2通過結(jié)合SLC22A17激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的JAK2/STAT3信號通路

為了闡明LCN2激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的分子機(jī)制，研究人員進(jìn)行了免疫熒光和免疫共沉淀實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LCN2與星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的SLC22A17受體存在共定位和直接結(jié)合。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，LCN2與SLC22A17的結(jié)合，激活了星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的JAK2/STAT3信號通路，進(jìn)而上調(diào)了CCL2的表達(dá)和分泌。使用LCN2中和抗體或敲低SLC22A17，均能顯著抑制LCN2誘導(dǎo)的JAK2/STAT3磷酸化、CCL2分泌以及巨噬細(xì)胞的招募。這些結(jié)果揭示了LCN2通過結(jié)合星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的SLC22A17受體，激活JAK2/STAT3信號通路，從而誘導(dǎo)CCL2分泌和巨噬細(xì)胞招募的分子機(jī)制。

巨噬細(xì)胞通過IL-1β/IL-1R/NF-κB通路正反饋上調(diào)腫瘤細(xì)胞LCN2表達(dá)

為了探究腦轉(zhuǎn)移灶中LCN2高表達(dá)的來源，研究人員發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是腦轉(zhuǎn)移微環(huán)境中IL-1β的主要來源。體外實驗證實，巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β能夠顯著上調(diào)腫瘤細(xì)胞中LCN2的表達(dá)。機(jī)制研究表明，IL-1β通過與其受體IL-1R結(jié)合，激活了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號通路，從而轉(zhuǎn)錄上調(diào)LCN2的表達(dá)。使用IL-1R拮抗劑阿那白滯素（anakinra）或NF-κB抑制劑，均能阻斷巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的LCN2上調(diào)。這些結(jié)果揭示了一個正反饋循環(huán)：腫瘤細(xì)胞分泌的LCN2激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，招募巨噬細(xì)胞；巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β又反過來進(jìn)一步上調(diào)腫瘤細(xì)胞的LCN2表達(dá)，從而形成了一個促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移進(jìn)展的惡性循環(huán)。

靶向IL-1β/IL-1R軸可抑制腦轉(zhuǎn)移的形成

為了評估靶向IL-1β/IL-1R軸的治療潛力，研究人員在小鼠模型中進(jìn)行了預(yù)防性和治療性研究。結(jié)果顯示，在腦轉(zhuǎn)移形成前預(yù)防性給予阿那白滯素，能夠顯著抑制腦轉(zhuǎn)移灶的生長并延長小鼠的生存期。然而，在腦轉(zhuǎn)移灶形成后進(jìn)行治療，阿那白滯素單藥治療無效。值得注意的是，STAT3抑制劑SH4-54單藥治療或與阿那白滯素聯(lián)合治療，均能有效抑制已建立的腦轉(zhuǎn)移灶的生長。這些結(jié)果表明，早期干預(yù)IL-1β/IL-1R軸可以預(yù)防腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生，而對于已形成的腦轉(zhuǎn)移灶，可能需要聯(lián)合靶向STAT3等其他通路才能取得更好的治療效果。

研究結(jié)論與討論

本研究系統(tǒng)性地揭示了LCN2在肺癌腦轉(zhuǎn)移中的核心作用。研究發(fā)現(xiàn)，LCN2通過一個復(fù)雜的腫瘤-微環(huán)境互作網(wǎng)絡(luò)，驅(qū)動腦轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。一方面，腫瘤細(xì)胞分泌的LCN2通過旁分泌方式，結(jié)合星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的SLC22A17受體，激活JAK2/STAT3信號通路，誘導(dǎo)CCL2等趨化因子的分泌，從而招募巨噬細(xì)胞。被招募的巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，通過IL-1R/NF-κB信號通路，正反饋上調(diào)腫瘤細(xì)胞的LCN2表達(dá)，形成了一個促進(jìn)腫瘤生長的惡性循環(huán)。另一方面，LCN2還通過自分泌方式，結(jié)合腫瘤細(xì)胞自身的SLC22A17受體，激活JAK2/STAT3信號通路，上調(diào)VEGF-A的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤的生長提供營養(yǎng)支持。

該研究不僅闡明了LCN2在腦轉(zhuǎn)移中的雙重驅(qū)動機(jī)制，還提出了具有轉(zhuǎn)化潛力的治療策略。研究證明，預(yù)防性抑制IL-1β/IL-1R軸可以打破惡性循環(huán)，抑制腦轉(zhuǎn)移的形成。對于已形成的腦轉(zhuǎn)移灶，靶向STAT3或VEGF-A通路能夠有效抑制腫瘤生長。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)針對肺癌腦轉(zhuǎn)移的新療法提供了重要的理論依據(jù)和實驗證據(jù)。LCN2不僅是一個關(guān)鍵的驅(qū)動因子，也可能作為預(yù)測STAT3靶向治療療效的生物標(biāo)志物。未來，開發(fā)能夠高效穿越血腦屏障的LCN2靶向藥物，或聯(lián)合靶向LCN2軸上的多個節(jié)點，有望為肺癌腦轉(zhuǎn)移患者帶來新的希望。

[1] Lipocalin-2 drives brain metastatic progression through reciprocal tumor-microenvironment interactions in lung cancer