1. 項(xiàng)目背景
凝血酶的生成是凝血途徑的核心，它催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白形成血栓。由于它在體內(nèi)的半衰期極短，只有幾秒鐘，因此測(cè)定困難。血漿凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）在纖維蛋白聚合物形成過(guò)程中產(chǎn)生，是凝血酶生成后與抗凝血酶1:1結(jié)合形成的復(fù)合物，在血漿的半衰期約3-15分鐘，可間接反映凝血酶的生成量，是凝血系統(tǒng)啟動(dòng)的標(biāo)志，可直接、靈敏地反映凝血系統(tǒng)的活化程度，并進(jìn)一步早期預(yù)測(cè)血栓的形成和再栓的復(fù)發(fā)。同時(shí)，TAT也是抗凝治療的敏感指標(biāo)，TAT水平升高提示凝血酶合成增加、凝血功能亢進(jìn)，機(jī)體處于高凝狀態(tài)。
日本血栓止血學(xué)會(huì)的學(xué)術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)《纖溶優(yōu)勢(shì)型DIC的病態(tài)診斷指南（2006年）》中，將“TAT≥20μg/L且PIC≥10μg/mL”作為診斷必要條件。即使是血小板計(jì)數(shù)＜120×109μg/mL的感染性疾病患者（仍存在血小板消耗性減少），如TAT＜7ng/mL，提示發(fā)生DIC風(fēng)險(xiǎn)較低。TAT對(duì)于感染性疾病患者的DIC趨勢(shì)預(yù)測(cè)，是一種陰性預(yù)測(cè)值較高的標(biāo)志物。下圖是TAT的作用機(jī)制。
2. 性能表現(xiàn)
針對(duì)血漿凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）的檢測(cè)，西寶生物推出4種單克隆抗體及1種抗原。具體性能如下（以下評(píng)估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗(yàn)證，建議客戶(hù)根據(jù)自身工藝進(jìn)行更為詳細(xì)的驗(yàn)證）
2.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
組合1：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964B）包被羧基磁珠+凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965B）標(biāo)記吖啶酯；
線(xiàn)性范圍：0.4 ng/mL-120 ng/mL；最低檢出限：0.4 ng/mL。
2.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)
組合1：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964C）包被羧基磁珠+凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965C）標(biāo)記堿性磷酸酶（DCE0108L）；
線(xiàn)性范圍：0.4 ng/mL-120 ng/mL；最低檢出限：0.4 ng/mL。
2.3 穩(wěn)定性評(píng)估
2.3.1 磁珠包被抗體穩(wěn)定性
采用磁珠標(biāo)記物稀釋液（貨號(hào)：DCD0532A）將凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964C）包被羧基磁珠濃縮液稀釋成磁珠工作液，進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。如表1所示：
TAT磁珠工作液?jiǎn)为?dú)37℃熱加速7天與2℃-8℃儲(chǔ)存7天發(fā)光值平均變化在±10%以?xún)?nèi)（不含S0），表明TAT磁珠工作液熱穩(wěn)定性良好。
表1 TAT磁珠工作液穩(wěn)定性7天數(shù)據(jù)
序號(hào) | TAT抗原稀釋 濃度ng/mL | TAT 磁珠工作液37℃ 熱加速7天與2℃ -8℃儲(chǔ)存7天發(fā)光值均值差異 |
S0 | 0 | -0.2% |
S1 | 2 | -5.4% |
S2 | 6.91 | -5.4% |
S3 | 16.88 | -10.7% |
S4 | 40.73 | -5.2% |
S5 | 70.95 | -7.6% |
平均變化（不含S0） | -6.9% | |
2.3.2 堿性磷酸酶標(biāo)記抗體及磁珠包被抗體穩(wěn)定性
采用堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記物稀釋液（貨號(hào)：DCD0533A）+5%左右的蛋白保護(hù)劑GH（貨號(hào)：DCL0009A）配成新的AP酶稀釋液，將凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965C）標(biāo)記堿性磷酸酶濃縮液稀釋成堿性磷酸酶工作液，進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。如表2所示：
堿性磷酸酶工作液?jiǎn)为?dú)37℃熱加速7天與2℃-8℃儲(chǔ)存7天發(fā)光值平均變化在±5%以?xún)?nèi)（不含S0），表明TAT堿性磷酸酶工作液熱穩(wěn)定性良好。
表2 TAT堿性磷酸酶工作液穩(wěn)定性7天數(shù)據(jù)
序號(hào) | TAT抗原稀釋 濃度ng/mL | TAT 堿性磷酸酶工作液37℃ 熱加速7天與2℃ -8℃儲(chǔ)存7天發(fā)光值均值差異 |
S0 | 0 | -1.4% |
S1 | 2 | -0.9% |
S2 | 6.91 | 3.2% |
S3 | 16.88 | 9.3% |
S4 | 40.73 | 1.7% |
S5 | 70.95 | 3.3% |
平均變化（不含S0） | 3.3% | |
3. 臨床相關(guān)性
3.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
西寶TAT抗體配對(duì)組合1（＜20 ng/mL）的發(fā)光值與希森美康 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2在0.94左右。
西寶TAT抗體配對(duì)組合1（＜120 ng/mL）的發(fā)光值與希森美康 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2在0.95左右。
3.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)
西寶TAT抗體配對(duì)組合2（＜20 ng/mL）的發(fā)光值與希森美康 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2在0.88左右。
西寶TAT抗體配對(duì)組合2（＜120 ng/mL）的發(fā)光值與希森美康 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2在0.95左右。
西寶TAT抗體配對(duì)組合2（＜120 ng/mL）的發(fā)光值與廣州萬(wàn)孚 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2＞0.95。
4. 測(cè)試方案
4.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)抗體配對(duì)組合1
樣本/校準(zhǔn)品:加樣量20ul；
試劑1：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0964B）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測(cè)試；
試劑2：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965B）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測(cè)試；
反應(yīng)條件：
第一步：20ul樣品+50ul試劑1，37℃孵育9min，清洗；
第二步：加入50ul試劑2，37℃孵育9min，清洗；
第三步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測(cè)試。
測(cè)試使用發(fā)光儀器:科斯邁SMART 500S。
4.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)抗體配對(duì)組合2
待測(cè)抗原：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物抗原（貨號(hào)：EDD0797B）
樣本/校準(zhǔn)品:加樣量10ul；
試劑1：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0964C）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測(cè)試；
試劑2：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965C）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測(cè)試；
反應(yīng)條件：
第一步：10ul樣品+50ul試劑1，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入50ul試劑2，37℃孵育10min，清洗；
第三步：加入底物，進(jìn)行測(cè)試。
測(cè)試使用發(fā)光儀器:迎凱Shine i2900。
5.產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 推薦配對(duì) |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體 | EKY0964B | 凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964B）包被羧基磁珠+凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0965B）標(biāo)記吖啶酯（發(fā)光配對(duì)組合1） |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體 | EKY0965B | |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體 | EKY0964C | 凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體3（貨號(hào)：EKY0964C）包被羧基磁珠+凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體4（貨號(hào)：EKY0965C）標(biāo)記堿性磷酸酶（發(fā)光配對(duì)組合2） |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體 | EKY0965C | |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964B）-羧基磁珠濃縮液 | DKY1327A | |
DKY1327B | ||
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964C）-羧基磁珠濃縮液 | DKY1327C | |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0965C）-堿性磷酸酶濃縮液 | DKY1327D | |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物抗原 | EDD0797B | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
AMPPD 發(fā)光底物液（即用型） | DCD0517B | |
蛋白保護(hù)劑GH | DCL0009A | 推薦使用濃度5%左右 |
重組堿性磷酸酶（高活性） | DCE0108L | |
磁珠標(biāo)記物稀釋液（化學(xué)發(fā)光） | DCD0532A | / |
堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記物稀釋液（化學(xué)發(fā)光） | DCD0533A | / |
1. 項(xiàng)目背景
凝血酶的生成是凝血途徑的核心，它催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白形成血栓。由于它在體內(nèi)的半衰期極短，只有幾秒鐘，因此測(cè)定困難。血漿凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）在纖維蛋白聚合物形成過(guò)程中產(chǎn)生，是凝血酶生成后與抗凝血酶1:1結(jié)合形成的復(fù)合物，在血漿的半衰期約3-15分鐘，可間接反映凝血酶的生成量，是凝血系統(tǒng)啟動(dòng)的標(biāo)志，可直接、靈敏地反映凝血系統(tǒng)的活化程度，并進(jìn)一步早期預(yù)測(cè)血栓的形成和再栓的復(fù)發(fā)。同時(shí)，TAT也是抗凝治療的敏感指標(biāo)，TAT水平升高提示凝血酶合成增加、凝血功能亢進(jìn)，機(jī)體處于高凝狀態(tài)。
日本血栓止血學(xué)會(huì)的學(xué)術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)《纖溶優(yōu)勢(shì)型DIC的病態(tài)診斷指南（2006年）》中，將“TAT≥20μg/L且PIC≥10μg/mL”作為診斷必要條件。即使是血小板計(jì)數(shù)＜120×109μg/mL的感染性疾病患者（仍存在血小板消耗性減少），如TAT＜7ng/mL，提示發(fā)生DIC風(fēng)險(xiǎn)較低。TAT對(duì)于感染性疾病患者的DIC趨勢(shì)預(yù)測(cè)，是一種陰性預(yù)測(cè)值較高的標(biāo)志物。下圖是TAT的作用機(jī)制。
2. 性能表現(xiàn)
針對(duì)血漿凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）的檢測(cè)，西寶生物推出4種單克隆抗體及1種抗原。具體性能如下（以下評(píng)估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗(yàn)證，建議客戶(hù)根據(jù)自身工藝進(jìn)行更為詳細(xì)的驗(yàn)證）
2.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
組合1：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964B）包被羧基磁珠+凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965B）標(biāo)記吖啶酯；
線(xiàn)性范圍：0.4 ng/mL-120 ng/mL；最低檢出限：0.4 ng/mL。
2.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)
組合1：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964C）包被羧基磁珠+凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965C）標(biāo)記堿性磷酸酶（DCE0108L）；
線(xiàn)性范圍：0.4 ng/mL-120 ng/mL；最低檢出限：0.4 ng/mL。
2.3 穩(wěn)定性評(píng)估
2.3.1 磁珠包被抗體穩(wěn)定性
采用磁珠標(biāo)記物稀釋液（貨號(hào)：DCD0532A）將凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964C）包被羧基磁珠濃縮液稀釋成磁珠工作液，進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。如表1所示：
TAT磁珠工作液?jiǎn)为?dú)37℃熱加速7天與2℃-8℃儲(chǔ)存7天發(fā)光值平均變化在±10%以?xún)?nèi)（不含S0），表明TAT磁珠工作液熱穩(wěn)定性良好。
表1 TAT磁珠工作液穩(wěn)定性7天數(shù)據(jù)
序號(hào) | TAT抗原稀釋 濃度ng/mL | TAT 磁珠工作液37℃ 熱加速7天與2℃ -8℃儲(chǔ)存7天發(fā)光值均值差異 |
S0 | 0 | -0.2% |
S1 | 2 | -5.4% |
S2 | 6.91 | -5.4% |
S3 | 16.88 | -10.7% |
S4 | 40.73 | -5.2% |
S5 | 70.95 | -7.6% |
平均變化（不含S0） | -6.9% | |
2.3.2 堿性磷酸酶標(biāo)記抗體及磁珠包被抗體穩(wěn)定性
采用堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記物稀釋液（貨號(hào)：DCD0533A）+5%左右的蛋白保護(hù)劑GH（貨號(hào)：DCL0009A）配成新的AP酶稀釋液，將凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965C）標(biāo)記堿性磷酸酶濃縮液稀釋成堿性磷酸酶工作液，進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。如表2所示：
堿性磷酸酶工作液?jiǎn)为?dú)37℃熱加速7天與2℃-8℃儲(chǔ)存7天發(fā)光值平均變化在±5%以?xún)?nèi)（不含S0），表明TAT堿性磷酸酶工作液熱穩(wěn)定性良好。
表2 TAT堿性磷酸酶工作液穩(wěn)定性7天數(shù)據(jù)
序號(hào) | TAT抗原稀釋 濃度ng/mL | TAT 堿性磷酸酶工作液37℃ 熱加速7天與2℃ -8℃儲(chǔ)存7天發(fā)光值均值差異 |
S0 | 0 | -1.4% |
S1 | 2 | -0.9% |
S2 | 6.91 | 3.2% |
S3 | 16.88 | 9.3% |
S4 | 40.73 | 1.7% |
S5 | 70.95 | 3.3% |
平均變化（不含S0） | 3.3% | |
3. 臨床相關(guān)性
3.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)
西寶TAT抗體配對(duì)組合1（＜20 ng/mL）的發(fā)光值與希森美康 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2在0.94左右。
西寶TAT抗體配對(duì)組合1（＜120 ng/mL）的發(fā)光值與希森美康 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2在0.95左右。
3.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)
西寶TAT抗體配對(duì)組合2（＜20 ng/mL）的發(fā)光值與希森美康 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2在0.88左右。
西寶TAT抗體配對(duì)組合2（＜120 ng/mL）的發(fā)光值與希森美康 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2在0.95左右。
西寶TAT抗體配對(duì)組合2（＜120 ng/mL）的發(fā)光值與廣州萬(wàn)孚 TAT發(fā)光試劑賦值臨床相關(guān)性R2＞0.95。
4. 測(cè)試方案
4.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺(tái)抗體配對(duì)組合1
樣本/校準(zhǔn)品:加樣量20ul；
試劑1：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0964B）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測(cè)試；
試劑2：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965B）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測(cè)試；
反應(yīng)條件：
第一步：20ul樣品+50ul試劑1，37℃孵育9min，清洗；
第二步：加入50ul試劑2，37℃孵育9min，清洗；
第三步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測(cè)試。
測(cè)試使用發(fā)光儀器:科斯邁SMART 500S。
4.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺(tái)抗體配對(duì)組合2
待測(cè)抗原：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物抗原（貨號(hào)：EDD0797B）
樣本/校準(zhǔn)品:加樣量10ul；
試劑1：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0964C）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測(cè)試；
試劑2：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào):EKY0965C）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測(cè)試；
反應(yīng)條件：
第一步：10ul樣品+50ul試劑1，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入50ul試劑2，37℃孵育10min，清洗；
第三步：加入底物，進(jìn)行測(cè)試。
測(cè)試使用發(fā)光儀器:迎凱Shine i2900。
5.產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 推薦配對(duì) |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體 | EKY0964B | 凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964B）包被羧基磁珠+凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0965B）標(biāo)記吖啶酯（發(fā)光配對(duì)組合1） |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體 | EKY0965B | |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體 | EKY0964C | 凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體3（貨號(hào)：EKY0964C）包被羧基磁珠+凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體4（貨號(hào)：EKY0965C）標(biāo)記堿性磷酸酶（發(fā)光配對(duì)組合2） |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體 | EKY0965C | |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964B）-羧基磁珠濃縮液 | DKY1327A | |
DKY1327B | ||
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0964C）-羧基磁珠濃縮液 | DKY1327C | |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）抗體（貨號(hào)：EKY0965C）-堿性磷酸酶濃縮液 | DKY1327D | |
凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物抗原 | EDD0797B | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
AMPPD 發(fā)光底物液（即用型） | DCD0517B | |
蛋白保護(hù)劑GH | DCL0009A | 推薦使用濃度5%左右 |
重組堿性磷酸酶（高活性） | DCE0108L | |
磁珠標(biāo)記物稀釋液（化學(xué)發(fā)光） | DCD0532A | / |
堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記物稀釋液（化學(xué)發(fā)光） | DCD0533A | / |
