在蛋白質(zhì)研究與應(yīng)用中，“精準(zhǔn)標(biāo)記”與“定向功能化”是突破技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵，不僅要保證蛋白質(zhì)天然活性不受影響，又要實(shí)現(xiàn)修飾分子的位點(diǎn)可控、高效偶聯(lián)。對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)偶聯(lián)的隨機(jī)修飾、產(chǎn)物不均一問(wèn)題，長(zhǎng)期制約著蛋白質(zhì)在科研與產(chǎn)業(yè)中的價(jià)值釋放。而分選酶A（SortaseA）介導(dǎo)的生物偶聯(lián)技術(shù)，以其“位點(diǎn)精準(zhǔn)、反應(yīng)溫和、普適性強(qiáng)”的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，業(yè)已成為蛋白質(zhì)標(biāo)記與功能化領(lǐng)域的“明星技術(shù)”，為各類應(yīng)用場(chǎng)景提供了標(biāo)準(zhǔn)化解決方案。
一、蛋白質(zhì)修飾的“精準(zhǔn)導(dǎo)航系統(tǒng)”
分選酶A具有嚴(yán)格的“底物識(shí)別-催化偶聯(lián)”機(jī)制：
識(shí)別精準(zhǔn)性：僅特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白上的LPXTG短肽標(biāo)簽，修飾分子需攜帶互補(bǔ)的甘氨酸序列，形成“鎖鑰式”配對(duì)。
反應(yīng)溫和性：無(wú)需高溫、強(qiáng)酸堿或有毒化學(xué)催化劑，在生理?xiàng)l件下（pH6.5-8.0、室溫）即可高效反應(yīng)。
偶聯(lián)穩(wěn)定性：催化形成的肽鍵在體內(nèi)外均具備高度穩(wěn)定性，不易水解或脫靶，解決了傳統(tǒng)化學(xué)偶聯(lián)（如馬來(lái)酰亞胺-巰基反應(yīng)）中修飾分子易脫落的問(wèn)題。
二、蛋白質(zhì)標(biāo)記與功能化的關(guān)鍵應(yīng)用場(chǎng)景
①熒光標(biāo)記與動(dòng)態(tài)追蹤：Dillard KE等人研究提出了一種分選酶介導(dǎo)的CRISPR-Cas復(fù)合物熒光標(biāo)記方案，其利用分選酶識(shí)別蛋白N端或C端的短肽標(biāo)簽，將小型熒光肽定點(diǎn)偶聯(lián)到CRISPR復(fù)合物上。這種標(biāo)記方式避免了傳統(tǒng)標(biāo)記中苛刻條件或大分子表位對(duì)CRISPR復(fù)合物活性的破壞，且分選酶在高離子強(qiáng)度、4℃等溫和條件下仍保持活性，兼容多種有機(jī)熒光團(tuán)。標(biāo)記后的復(fù)合物可用于DNA幕簾技術(shù)中的單分子熒光成像，實(shí)現(xiàn)對(duì)CRISPR-Cas復(fù)合物與DNA相互作用的動(dòng)態(tài)追蹤【1】
圖：N-terminal sortase labeling of Cas1-Cas2. Structure of Cas1-Cas2 complexed with DNA
②生物素標(biāo)記與高靈敏度檢測(cè)：有研究首次證實(shí)分選酶A的非典型異肽連接活性可用于重組蛋白修飾。實(shí)驗(yàn)中，研究者用生物素修飾的LPETG肽作為底物，在分選酶A催化下，將生物素特異性偶聯(lián)到Fn3-PLN3-ELP融合蛋白的菌毛結(jié)構(gòu)域賴氨酸上，之后通過(guò)鏈霉親和素-Cy5進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)合SDS-PAGE和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜驗(yàn)證，只有含菌毛結(jié)構(gòu)域和生物素修飾LPETG肽的反應(yīng)體系才會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)蛋白的生物素化條帶。該方式實(shí)現(xiàn)了生物素對(duì)蛋白特定位點(diǎn)的精準(zhǔn)標(biāo)記，借助鏈霉親和素系統(tǒng)達(dá)成了目標(biāo)蛋白的高靈敏度鑒定?！?】
圖：Sortase A catalyzes protein-small molecule isopeptide ligation
③位點(diǎn)特異性交聯(lián)：為實(shí)時(shí)觀察流感病毒出芽過(guò)程中糖蛋白的動(dòng)態(tài)，研究者采用分選酶A介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性標(biāo)記策略。研究者先對(duì)流感病毒的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）這兩種糖蛋白進(jìn)行基因修飾，使其攜帶LPXTG識(shí)別序列。隨后用分選酶A催化含特定功能基團(tuán)的寡甘氨酸探針與糖蛋白交聯(lián)標(biāo)記。該標(biāo)記方式可在感染狀態(tài)下特異性標(biāo)記病毒糖蛋白，且不影響病毒活性，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)流感病毒糖蛋白的定位追蹤，為解析病毒包膜成分組裝及病毒顆粒形成的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵工具?！?】
圖： Structural representation of sortase cleavage site mutations in hemagglutinin and neuraminidase
分選酶A正以其“位點(diǎn)精準(zhǔn)、反應(yīng)溫和、普適性強(qiáng)”的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，正重新塑造蛋白質(zhì)標(biāo)記與功能化的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。無(wú)論是科研還是企業(yè)需求，分選酶A都提供了最優(yōu)選擇，因此正成為推動(dòng)蛋白質(zhì)科學(xué)與生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新的核心動(dòng)力！
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Seebio? 分選酶A（Sortase A） | ECE0720A-50μg | 50μg/100μg/1mg/支 |
相關(guān)產(chǎn)品
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Seebio? 重組煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEV酶） | EBY3644B | 5mg/10mg |
Seebio?TEV 蛋白酶（TEV Protease）活性測(cè)定試劑盒(熒光法) | EKM0101B | 50T |
SUMO 蛋白酶(凍干粉) | EAE0087A | 1mg |
重組腸激酶 | ECE1123A | 100U |
大腸桿菌表達(dá)重組腸激酶（不帶標(biāo)簽） | DAA1065A | 100U |
重組HRV 3C蛋白酶 | FCE1220A | 1KU |
參考文獻(xiàn)
【1】Dillard KE, Schaub JM, Brown MW, Saifuddin FA, Xiao Y, Hernandez E, Dahlhauser SD, Anslyn EV, Ke A, Finkelstein IJ. Sortase-mediated fluorescent labeling of CRISPR complexes. Methods Enzymol. 2019;616:43-59. doi: 10.1016/bs.mie.2018.10.031.
【2】Bellucci JJ, Bhattacharyya J, Chilkoti A. A noncanonical function of sortase enables site-specific conjugation of small molecules to lysine residues in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Jan 7;54(2):441-5. doi: 10.1002/anie.201408126.
【3】Popp MW, Karssemeijer RA, Ploegh HL. Chemoenzymatic site-specific labeling of influenza glycoproteins as a tool to observe virus budding in real time. PLoS Pathog. 2012;8(3):e1002604. doi: 10.1371/journal.ppat.1002604.
在蛋白質(zhì)研究與應(yīng)用中，“精準(zhǔn)標(biāo)記”與“定向功能化”是突破技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵，不僅要保證蛋白質(zhì)天然活性不受影響，又要實(shí)現(xiàn)修飾分子的位點(diǎn)可控、高效偶聯(lián)。對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)偶聯(lián)的隨機(jī)修飾、產(chǎn)物不均一問(wèn)題，長(zhǎng)期制約著蛋白質(zhì)在科研與產(chǎn)業(yè)中的價(jià)值釋放。而分選酶A（SortaseA）介導(dǎo)的生物偶聯(lián)技術(shù)，以其“位點(diǎn)精準(zhǔn)、反應(yīng)溫和、普適性強(qiáng)”的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，業(yè)已成為蛋白質(zhì)標(biāo)記與功能化領(lǐng)域的“明星技術(shù)”，為各類應(yīng)用場(chǎng)景提供了標(biāo)準(zhǔn)化解決方案。
一、蛋白質(zhì)修飾的“精準(zhǔn)導(dǎo)航系統(tǒng)”
分選酶A具有嚴(yán)格的“底物識(shí)別-催化偶聯(lián)”機(jī)制：
識(shí)別精準(zhǔn)性：僅特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白上的LPXTG短肽標(biāo)簽，修飾分子需攜帶互補(bǔ)的甘氨酸序列，形成“鎖鑰式”配對(duì)。
反應(yīng)溫和性：無(wú)需高溫、強(qiáng)酸堿或有毒化學(xué)催化劑，在生理?xiàng)l件下（pH6.5-8.0、室溫）即可高效反應(yīng)。
偶聯(lián)穩(wěn)定性：催化形成的肽鍵在體內(nèi)外均具備高度穩(wěn)定性，不易水解或脫靶，解決了傳統(tǒng)化學(xué)偶聯(lián)（如馬來(lái)酰亞胺-巰基反應(yīng)）中修飾分子易脫落的問(wèn)題。
二、蛋白質(zhì)標(biāo)記與功能化的關(guān)鍵應(yīng)用場(chǎng)景
①熒光標(biāo)記與動(dòng)態(tài)追蹤：Dillard KE等人研究提出了一種分選酶介導(dǎo)的CRISPR-Cas復(fù)合物熒光標(biāo)記方案，其利用分選酶識(shí)別蛋白N端或C端的短肽標(biāo)簽，將小型熒光肽定點(diǎn)偶聯(lián)到CRISPR復(fù)合物上。這種標(biāo)記方式避免了傳統(tǒng)標(biāo)記中苛刻條件或大分子表位對(duì)CRISPR復(fù)合物活性的破壞，且分選酶在高離子強(qiáng)度、4℃等溫和條件下仍保持活性，兼容多種有機(jī)熒光團(tuán)。標(biāo)記后的復(fù)合物可用于DNA幕簾技術(shù)中的單分子熒光成像，實(shí)現(xiàn)對(duì)CRISPR-Cas復(fù)合物與DNA相互作用的動(dòng)態(tài)追蹤【1】
圖：N-terminal sortase labeling of Cas1-Cas2. Structure of Cas1-Cas2 complexed with DNA
②生物素標(biāo)記與高靈敏度檢測(cè)：有研究首次證實(shí)分選酶A的非典型異肽連接活性可用于重組蛋白修飾。實(shí)驗(yàn)中，研究者用生物素修飾的LPETG肽作為底物，在分選酶A催化下，將生物素特異性偶聯(lián)到Fn3-PLN3-ELP融合蛋白的菌毛結(jié)構(gòu)域賴氨酸上，之后通過(guò)鏈霉親和素-Cy5進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)合SDS-PAGE和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜驗(yàn)證，只有含菌毛結(jié)構(gòu)域和生物素修飾LPETG肽的反應(yīng)體系才會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)蛋白的生物素化條帶。該方式實(shí)現(xiàn)了生物素對(duì)蛋白特定位點(diǎn)的精準(zhǔn)標(biāo)記，借助鏈霉親和素系統(tǒng)達(dá)成了目標(biāo)蛋白的高靈敏度鑒定?！?】
圖：Sortase A catalyzes protein-small molecule isopeptide ligation
③位點(diǎn)特異性交聯(lián)：為實(shí)時(shí)觀察流感病毒出芽過(guò)程中糖蛋白的動(dòng)態(tài)，研究者采用分選酶A介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性標(biāo)記策略。研究者先對(duì)流感病毒的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）這兩種糖蛋白進(jìn)行基因修飾，使其攜帶LPXTG識(shí)別序列。隨后用分選酶A催化含特定功能基團(tuán)的寡甘氨酸探針與糖蛋白交聯(lián)標(biāo)記。該標(biāo)記方式可在感染狀態(tài)下特異性標(biāo)記病毒糖蛋白，且不影響病毒活性，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)流感病毒糖蛋白的定位追蹤，為解析病毒包膜成分組裝及病毒顆粒形成的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵工具。【3】
圖： Structural representation of sortase cleavage site mutations in hemagglutinin and neuraminidase
分選酶A正以其“位點(diǎn)精準(zhǔn)、反應(yīng)溫和、普適性強(qiáng)”的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，正重新塑造蛋白質(zhì)標(biāo)記與功能化的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。無(wú)論是科研還是企業(yè)需求，分選酶A都提供了最優(yōu)選擇，因此正成為推動(dòng)蛋白質(zhì)科學(xué)與生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新的核心動(dòng)力！
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重組HRV 3C蛋白酶 | FCE1220A | 1KU |
參考文獻(xiàn)
【1】Dillard KE, Schaub JM, Brown MW, Saifuddin FA, Xiao Y, Hernandez E, Dahlhauser SD, Anslyn EV, Ke A, Finkelstein IJ. Sortase-mediated fluorescent labeling of CRISPR complexes. Methods Enzymol. 2019;616:43-59. doi: 10.1016/bs.mie.2018.10.031.
【2】Bellucci JJ, Bhattacharyya J, Chilkoti A. A noncanonical function of sortase enables site-specific conjugation of small molecules to lysine residues in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Jan 7;54(2):441-5. doi: 10.1002/anie.201408126.
【3】Popp MW, Karssemeijer RA, Ploegh HL. Chemoenzymatic site-specific labeling of influenza glycoproteins as a tool to observe virus budding in real time. PLoS Pathog. 2012;8(3):e1002604. doi: 10.1371/journal.ppat.1002604.
